专利名称：沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测试剂盒的制作方法: 淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体是一类由性接触为主要传播途径的病原体，它们可分别引发淋病和非淋球菌性尿道炎。淋病是目前世界上发病较多的性病之一，每年以20% 30%速度递增，由于滥用抗生素及反复感染，导致淋病的临床表现缺乏特异性，尤其女性，感染初期的60% 70%呈现无症状过程，如不及时诊断治疗，既可成为潜在传染源，也有学者认为盆腔炎也是由此菌引物，从而损伤输卵管及卵巢，引起宫外孕和不育症等，故实验室检查对临床确诊及治疗有重大意义沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, CT)感染为美国最常见的性传播疾病(STD)，每年有4 5百万病例发生，每年花费可达40亿美元。据世界卫生组织(WHO)估计，每年有9，200万新的CT感染病例发生。在发展中国家其发生率也呈逐年上升趋势。CT可引起沙眼、泌尿生殖道感染、尿道炎、附睾炎及不孕不育等。支原体感染男女泌尿生殖道的发病率成逐年上升趋势，女性下生殖道是支原体感染好发的部位，上行还可以子宫腔和输卵管腔从而引起炎症和并发症。吴志芬等对无锡市1600例男女生殖道感染者进行支原体检测，其中解脲脲原体的感染率为42.3%，表明支原体的感染率高，已构成流行。近年来解脲支原体的致病机理和流行病学研究得到了充分的重视。最近的研究表明，解脲支原体应该分为两个独立的种，即细小脲原体(Ureaplasmaparvum.原解脲支原体生物一群)和解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum),生殖道分离到的解脲支原体以细小脲原体为主。解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,简称UU)和沙眼衣原体是常见的性传播疾病病原体，在临床非淋菌性尿道炎(简称NGU)病人中，二者常常呈共同感染状态；在性传播疾病中解脲脲原体与非淋菌性尿道炎、附睾炎有关；与前列腺炎、女性尿道症状、肾盂肾炎、盆腔炎有明显相关性或提示有病原学作用。淋病奈瑟菌的实验室诊断主要依靠细菌培养，该法准确可靠，但往往需要2 3天才能得到结果，且常因标本采集方法和运送方式不正确，而使淋病奈瑟菌死亡造成培养失败，使培养阳性率偏低。涂片法操作简单，但缺乏特异性，而且受采集、涂片、染色、镜检等操作过程中的主观因素影响造成漏检。核酸检测法快速、灵敏度和特异度高，是近年来发展的有效方法，但成本较高。衣原体的实验室诊断主要有细胞培养技术、直接涂片镜检技术、抗原抗体免疫技术、聚合酶链反应、连接酶链反应和糖元试验。直接涂片镜检、免疫胶体金法为临床常用的方法；自动酶联免疫法(VIDAS)，仪器昂贵，检测成本较高；PCR通过方法学及试剂的改进，有望成为临床首选使用方法；LCR为目前已知较理想的方法，但其仅器昂贵，难以在基层推广；细胞培养技术为衣原体实验室诊断的黄金标准，但在医院由于费时等原因难以推广。支原体的实验室诊断包括分离培养法、免疫学方法和分子生物学方法。在标本中分离培养出支原体对支原体感染的诊断有决定性的意义。但该法灵敏度低，时间长，不利于早期快速诊断。ELISA法敏感性和特异性高，重复性好，简便、快速，可以测定抗体或抗原，有广阔的应用前景。PCR法存在假阳性和假阴性，但此法快速、简便、特异且敏感，众多的优点使其在临床上可能得到广泛应用。采用多重不对称PCR方法结合反向线点杂交技术可以大大提高杂交的效率，而且操作方便。因此，研制和开发一种可利用导流杂交技术快速、简便、特异、敏感检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体的产品具有重要的意义
:本发明提供一种淋球菌、沙眼衣原体、解脲脲原体和细小脲原体的检测方法和试剂盒，包括:(I) 一种特殊设计的引物，该引物使用MAP方法(正在申请中)设计，每条引物有PU P2和P3这样3个功能区构成，这种设计方法保证了引物有较宽泛的退火温度范围，使多重PCR扩增条件不兼容的情况大幅改善，提高了成功率，本弓I物在试剂盒内以IOx混合物形式存在。(2)本试剂盒提供了可以特异的鉴别4个病原体的引物序列和探针。(3) 一种特殊的扩增策略，称为多重不对称PCR(MAP)，该扩增方法可以产生大量单链核酸序列。(4) 一个预制的低密度尼龙膜基因芯片，其上带有氨基酸臂修饰的特异性探针序列，每种探针可以检测特异的病原体。(5)固体形式存在的PCR反应物，其配方为:UNG酶、热启动聚合酶、Tris-Hcl、KCl、dNTPs (AGCU)、]\%(:12、甘油、01^0、海藻糖、粘合剂。(6)阳性模板参考品和阴性参考品。(7)本发明使用反向线点杂交(RLB)方法进行核酸检测，优化了反向线点杂交的程序，节约了部分时间。试剂盒方法:I)引物设计:引物设计使用发表在NCBI上不同病原体核酸序列的保守区域设计P3段引物，然后设计P2段和Pl段引物，其中用字母n代替hypoxanthine碱基，hypoxanthine碱基可以和四种碱基配对；对于每种病原体的引物序列群，其内引物5’端标记有生物素。 引物序列表:可检测病原体引物名引物序列号引物序列沙眼衣原体MOFlSEQ ID N0.1 GtcaannnnGgattcctgtaacaacaagtcagg本发明提供了一种沙眼衣原体、解脲脲原体、细小脲原体和淋球菌的检测方法和试剂盒，其特征在于使用了MAP方法设计引物，每条引物由3段构成，此设计能使引物的退火温度变得宽泛；对于每个病原体设计了4个引物，扩增反应包括富集阶段和扩增阶段，扩增时仅有内引物标记生物素并且过量；提供了固体形式存在的PCR反应物，预制的生物素标记探针的尼龙膜和阳性对照品。