器官的停止、保护和保存制作方法_G·P·多布森专利（器官,保存,停止）-早鸽网

器官的停止、保护和保存制作方法

专利名称

器官的停止、保护和保存制作方法
发明者

G·P·多布森
公开日

2002年4月10日
申请日期

2000年3月22日
优先权日

1999年3月23日
申请人

詹姆斯库克大学
文档编号

A61K31/4409GK1344135SQ00805408
关键字

器官保存停止保护
权利要求

1.一种停止、保护和/或保存器官的方法，其特征在于，所述的方法包括给予有此需要的对象有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的器官可以是对象体内完整的器官，也可以是分离的完整器官3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的器官是循环器官、呼吸器官、泌尿器官、消化器官、生殖器官、神经器官或体细胞4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的循环器官是心脏5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的方法是用于在心脏直视手术过程中停止、保护和/或保存心脏；在心血管介入性治疗之前、期间或之后减少心脏的受损；或保护那些已经历缺少正常血流、营养和/或氧气的心脏部分6.如权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的钾通道开启剂或促效剂选自尼可地尔、二氮嗪、米诺地尔、吡那地尔、阿里卡林、克罗卡林、NS-1619(1，3-二氢-1-[2-羟基-5-(三氟甲基)苯基]-5-(三氟甲基)-2-H-苯并咪唑-酮)、氨氯地平、Bay K86644(L型)(1，4-二氢-2，6-二甲基-5-硝基-4-[2(三氟甲基)苯基]-3-吡啶羧酸(甲酯)、苄普地尔HCl(L型)、钙赛普汀(L型)、ω-芋螺毒素GVIA(N型)、ω-芋螺毒素MVIIC(Q型)、HCl赛康啶、丹曲林钠(Ca2+释放抑制剂)、HCl地尔硫?(L型)、非洛地平、氟桂嗪HCl(Ca2+/Na+)、弗斯匹林(L型)、HA-10772HCl(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪·HCl)、伊拉地平、洛哌丁胺HCl、曼诺力得(Ca2+释放抑制剂)、HCl尼卡地平(L型)、硝苯地平(L型)、HCl尼古地平(L型)、尼莫地平(L型)、尼群地平(L型)、匹莫齐特(L-和T-型)、钌红、斯里兰卡肉桂碱(SR通道)、taicatoxin、维拉帕米HCl(L型)、HCl甲氧基-维拉帕米(L型)、YS-035HCl(L型)N[2(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-3，4-二甲氧基-N-甲基苯乙胺HCl)和AV封阻剂7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的AV封阻剂是腺苷8.如权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述的腺苷受体促效剂选自N6-环戊基腺苷(CPA)、N-乙基羧酰胺基腺苷(NEAC)、2-[p-(2-羧基乙基)苯乙基-氨基-5’-N-乙基羧酰胺基腺苷(CGS-21680)、2-氯腺苷、N6-[2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)乙基腺苷、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、N-(4-氨基苄基)-9-[5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖基]-腺苷(AB-MECA)、([IS-[1a，2b，3b，4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-氯-2-噻吩基)-1-甲基-丙基]氨基]-3H-咪唑[4，5-b]吡啶基-3-基]环戊烷甲酰胺(AMP579)、N6-(R)-苯基异丙基腺苷(R-PLA)、氨基苯基乙基腺苷(APNEA)和环己基腺苷(CHA)9.如权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，所述的局部麻醉剂选自美西律、二苯海因丙胺卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、马比佛卡因、和1B类抗心律失常药10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的1B类抗心律失常药是利多卡因11.如权利要求1-10任一所述的方法，其特征在于，所述的活性成分(i)和(ii)与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂一起给予12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂是pH约为6-9的缓冲液13.如权利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂含有低浓度的钾14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的钾的浓度至多约为10mM15.如权利要求12-14任一所述的方法，其特征在于，所述的缓冲液是Krebs-Henseleit、St.Thomas No.2溶液、Tyrodes溶液、Fremes溶液、Hartmanns溶液或Ringers-Lactate16.如权利要求11-15任一所述的方法，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂含有低浓度的镁17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述的镁的浓度至多约为2.5mM18.如权利要求1-17任一所述的方法，其特征在于，所述的活性成分(i)和(ii)与其他药物一起给予19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的药物是双嘧达莫或凝块破裂药20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述的凝块破裂药是链激酶21.如权利要求1-20任一所述的方法，其特征在于，所述的对象是新生儿/婴儿22.如权利要求4-21任一所述的方法，其特征在于，所述的在心血管应用中的给药是通过将活性成分与对象和/或有类似血型的对象的血液混合完成23.如权利要求1-22任一所述的方法，其特征在于，所述的停止是通过连续或间歇送递实现的24.如权利要求1-23任一所述的方法，其特征在于，所述的停止是在约15℃-37℃进行的25.(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂在制备用于停止、保护和/或保存器官的药物中的用途26.(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂在停止、保护和/或保存器官中的用途27.一种停止、保护和/或保存器官的方法，其特征在于，所述的方法包括给予器官有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或器官受体促效剂和(ii)局部麻醉剂28.一种药物组合物或兽用组合物，其特征在于，所述的组合物含有有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂29.如权利要求28所述的组合物，其特征在于，所述的钾通道开启剂或促效剂选自尼可地尔、二氮嗪、米诺地尔、吡那地尔、阿里卡林、克罗卡林、NS-1619(1，3-二氢-1-[2-羟基-5-(三氟甲基)苯基]-5-(三氟甲基)-2-H-苯并咪唑-酮)、氨氯地平、Bay K86644(L型)(1，4-二氢-2，6-二甲基-5-硝基-4-[2(三氟甲基)苯基]-3-吡啶羧酸(甲酯)、苄普地尔HCl(L型)、钙赛普汀(L型)、ω-芋螺毒素GVIA(N型)、ω-芋螺毒素MVIIC(Q型)、HCl赛康啶、丹曲林钠(Ca2+释放抑制剂)、HCl地尔硫?(L型)、非洛地平、氟桂嗪HCl(Ca2+/Na+)、弗斯匹林(L型)、HA-1077 2HCl(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪·HCl)、伊拉地平、洛哌丁胺HCl、曼诺力得(Ca2+释放抑制剂)、HCl尼卡地平(L型)、硝苯地平(L型)、HCl尼古地平(L型)、尼莫地平(L型)、尼群地平(L型)、匹莫齐特(L-和T-型)、钌红、斯里兰卡肉桂碱(SR通道)、taicatoxin、维拉帕米HCl(L型)、HCl甲氧基-维拉帕米(L型)、YS-035HCl(L型)N[2(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-3，4-二甲氧基-N-甲基苯乙胺HCl)和AV封阻剂30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述的AV封阻剂是腺苷31.如权利要求28-30任-所述的组合物，其特征在于，所述的腺苷受体促效剂选自N6-环戊基腺苷(CPA)、N-乙基羧酰胺基腺苷(NEAC)、2-[p-(2-羧基乙基)苯乙基-氨基-5’-N-乙基羧酰胺基腺苷(CGS-21680)、2-氯腺苷、N6-[2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)乙基腺苷、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、N-(4-氨基苄基)-9-[5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖基]-腺苷(AB-MECA)、([IS-[1a，2b，3b，4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-氯-2-噻吩基)-1-甲基-丙基]氨基]-3H-咪唑[4，5-b]吡啶基-3-基]环戊烷甲酰胺(AMP579)、N6-(R)-苯基异丙基腺苷(R-PLA)、氨基苯基乙基腺苷(APNEA)和环己基腺苷(CHA)32.如权利要求28-31任一所述的组合物，其特征在于，所述的局部麻醉剂选自美西律、二苯海因丙胺卡因、丙胺卡因、普鲁卡因、马比佛卡因、和1B类抗心律失常药33.如权利要求28-32任一所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是心麻痹或心保护组合物34.如权利要求28-33任一所述的组合物，其特征在于，所述的活性成分(i)和(ii)是与药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂一起给予的35.如权利要求34所述的组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂是pH约为6-9的缓冲液36.如权利要求34或35所述的组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂含有低浓度的钾37.如权利要求36所述的组合物，其特征在于，所述的钾的浓度至多约为10mM38.如权利要求35-37任一所述的组合物，其特征在于，所述的缓冲液是Krebs-Henseleit、St.Thomas No.2溶液、Tyrodes溶液、Fremes溶液、Hartmanns溶液或Ringers-Lactate39.如权利要求34-38任一所述的组合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂含有低浓度的镁40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述的镁的浓度至多约为2.5mM41.如权利要求29-40任一所述的组合物，其特征在于，所述的活性成分(i)和(ii)与其他药物一起给予42.如权利要求41所述的组合物，其特征在于，所述的药物是双嘧达莫或凝块破裂药43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述的凝块破裂药是链激酶
技术领域

本发明涉及用于停止(停跳)、保护和/或保存器官(尤其是心脏直视手术、心血管诊断或治疗性介入时的心脏)的方法和药物或兽用组合物每年在澳大利亚有20,000次以上的心脏直视手术，在美国则超过800,000次，在欧洲有1,000,000次左右在这些需要心脏直视手术的人约1.2％是新生儿/婴儿，主要是因为先天性心脏病在心脏直视手术(open heart surgery)中可能需要停止心博长达3小时高钾心麻痹(超过15-20mM)用作心肌停止和保护的基础已有40多年目前所使用的大部分溶液含有高钾包括广泛使用的St Thomas No.2 Hospital溶液，其通常含有110mM NaCl、16mM KCl、16mM MgCl2、1.2mM CaCl2和10mMNaHCO3，且pH约为7.8高钾溶液通常导致膜去极化从约-80到-50mV尽管高钾溶液能提供令人接受的临床结果，但是最近有证据表明进行性钾引发的去极化导致离子和代谢失衡，这可能与再灌注过程中的心肌功能丧失、室性心律失常、缺血性损伤、内皮细胞肿胀、微脉管受损、细胞死亡和泵功能丧失有关与成年人的心脏相比，婴儿的心脏更易被高钾的心麻痹停止而受到损伤假设的主要离子失衡与钠内流的增加相连，继而活化Na+/Ca2+交换从而导致细胞内Ca2+升高然后就发生了Na+和Ca2+离子泵的代偿性活化，激活厌氧代谢补充了ATP，并伴发组织的乳酸盐增加和组织的pH下降在钾停止中还连累到自由基的产生和氧化性应激反应，通过给予抗氧化剂可部分逆转在一些情况中，已报道了高钾引发的缺血将损伤平滑肌和内皮的功能为了将心麻痹停止中的缺血损伤最小化，有大量实验研究使用钾通道开启剂来替代高钾据信使用尼可地尔、阿里卡林、或松脂的心脏保护与钾通道的开启有关，其导致超极化状态、动作电位的缩短和流入细胞的Ca2+流减少但存在的一个缺点是与高钾心麻痹溶液相比，在相同或更长时间恢复后功能并没有改善另一缺陷是由于松脂在水溶液中的低溶解性所以需要载体常规使用的载体是二甲基亚砜(DMSO)，在用于动物或人的治疗中是有争议的大部分研究者包括那些提倡使用钾通道开启剂的研究者，认为一旦将血流停止并给予停止溶液，就发生缺血且随着时间而不断增加为了降低危险的可能性，我们寻找到一种心脏麻痹的溶液，能将心脏置于一种可逆的代谢减退状态(模拟于冬眠海龟、蛰伏的蜂鸟或夏眠的沙漠蛙(desert-frog)等的组织)当这些动物的代谢速率降低(有些达到90％以上)，它们的组织不再变成进行性缺血，但保持在下调的稳定状态，这期间供给和需求相匹配理想的心麻痹溶液应能产生易逆转、快速的电化学停止，而组织的缺血最小心脏应积聚较小量的组织乳酸盐，利用小量糖原，表现出高能磷酸盐胞液氧化还原(NAD/NADH)和生物能磷酸化(ATP/ADP Pi)的比例和ATP自由能等变化最小胞液pH和游离镁离子可以有很小的变化或没有变化，或在细胞内液和细胞外液间只有最少量水的迁移，和对细胞器如线粒体没有重要的超微结构的损伤理想的心麻痹溶液应能100％功能性恢复，而无室性心律失常、胞液钙过量或其他泵功能异常而至今未有能满足所有这些要求的心麻痹溶液现在我们发现可以用钾通道开启剂腺苷和局部麻醉的利多卡因，在停止和恢复过程中较好地保护心脏人们对腺苷的作用是有争议的腺苷已表明能增加冠脉血流量、使细胞膜超级化和通过ATP-敏感的钾通道和腺苷相关的通路(包括腺苷受体特别是A1受体)作为预处理剂已知腺苷能改善心肌恢复，以辅助高钾心麻痹另外，腺苷还能用于预处理(无论其是否存在于停止溶液中)以减少致死的伤害在一项研究中，腺苷表明可与钾停止溶液相媲美，且在最近的血液心麻痹中其防止了缺血损伤心脏的缺血后功能紊乱有时将腺苷作为辅助剂加到钾心麻痹中利多卡因是一种局部麻醉剂，其封阻钠快速通道，且通过降低内向钠流的量值具有抗心律失常的特性据信伴随动作电位的缩短直接减少钙通过Ca2+选择性通道和Na+/Ca2+交换而进入细胞最近报道还表明在再灌注过程中利多卡因与清除心脏中的游离基如羟基或单态氧有关与这种清除功能相联，利多卡因还可抑制磷酸酯酶的活性和最小化缺血过程中的膜退化利多卡因还表现出具有保护心肌的作用，在一项研究中发现比高钾溶液更出众但我们的实验显示单用0.5、1.0和1.5mM的利多卡因得到高度易变的功能恢复(用分离的博动的大鼠心脏)一方面，本发明提供了一种停止、保护和/或保存器官的方法，所述的方法包括给予需要的对象有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂另一方面，本发明提供了(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂在制备用于停止、保护和/或保存器官的药物中的用途本发明还提供了(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂，用于停止、保护和/或保存器官另一方面，本发明还提供了药物或兽用组合物，包括有效量的(i)钾通道开启剂和/或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂本发明特别适用于停止、保护和/或保存对象体内完整的器官，可以看出也可用于停止、保护和/或保存分离的器官所以，本发明还提供了停止、保护和/或保存器官的方法，包括给予一种组合物，该组合物含有有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)该器官的局部麻醉剂本文所用的术语“加入”指其最广泛的含义，即将本发明的组合物与器官接触的任何方法，例如浸浴、灌注或通过各种途径的泵送本文所用的所用“器官”也是取其最广泛的含义，指具有特性功能的身体的任何部位包括组织和细胞或它们的一部分，例如细胞株或细胞器制备物其他例子包括循环器官(如心脏)、呼吸器官(如肺)、泌尿器官(如肾和膀胱)、消化器官(如胃、肝、胰或脾)、生殖器官(如阴囊、睾丸、卵巢或子宫)、神经器官(如脑)、生殖细胞(如精子或卵子)和体细胞(如皮肤细胞、心脏细胞)即肌细胞、神经细胞、脑细胞或肾细胞本发明的方法特别适用于在心脏直视手术(包括心脏移植)中停止、保护和/或保存心脏其他应用包括在心血管介入性治疗之前、期间或之后(可能包括心脏病发作、血管成形或血管造影)减少心脏的损伤例如，可将组合物给予患或正发展心脏病的对象，且还可在使用溶血凝药如链激酶的同时给药一旦凝块溶解，存在的组合物就可保护心脏免受进一步的伤害如重灌注损伤对那些缺少正常血流、营养和/或氧(不同时间段)的心脏部分而言该组合物可作为心脏保护剂特别有效例如，可用该组合物治疗在心血管介入性治疗前存在的或由其引发的心脏缺血所以，本发明还提供了心脏麻痹性或心脏保护性组合物，它包括有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂钾通道开启剂或促效剂可选自尼可地尔、二氮嗪、米诺地尔、吡那地尔(pinicadil)、阿里卡林(aprikalim)、克罗卡林(cromokulim)、NS-1619(1，3-二氢-1-[2-羟基-5-(三氟甲基)苯基]-5-(三氟甲基)-2-H-苯并咪唑(benimidazol)-酮)、氨氯地平、Bay K86644(L型)(1，4-二氢-2，6-二甲基-5-硝基-4-[2(三氟甲基)苯基]-3-吡啶羧酸(甲酯)、苄普地尔HCl(L型)、钙赛普汀(calciseptine)(L型)、ω-芋螺毒素GVIA(N型)、ω-芋螺毒素MVIIC(Q型)、HCl赛康啶、丹曲林钠(Ca2+释放抑制剂)、HCl地尔硫?(L型)、非洛地平(filodipine)、氟桂嗪HCl(Ca2+/Na+)、弗斯匹林(L型)、HA-1077 2HCl(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪·HCl)、伊拉地平、洛哌丁胺HCl、曼诺力得(Ca2+释放抑制剂)、HCl尼卡地平(L型)、硝苯地平(L型)、HCl尼古地平(L型)、尼莫地平(L型)、尼群地平(L型)、匹莫齐特(L-和T-型)、钌红、斯里兰卡肉桂碱(SR通道)、taicvatoxin、维拉帕米HCl(L型)、HCl甲氧基-维拉帕米(L型)、YS-035HCl(L型)N[2(3，4-二甲氧基苯基)乙基]-3，4-二甲氧基-N-甲基苯乙胺HCl)和AV封阻剂如维拉帕米和腺苷可以理解以上列出的包括钙拮抗剂，因为钾通道开启剂是间接钙拮抗剂腺苷是特别优选的，因为它能开启钾通道、超极化细胞、抑制代谢功能、还可能保护内皮细胞、提高组织的预先准备和保护免受缺血或损伤腺苷还是间接的钙拮抗剂、血管舒张剂、抗心率失常剂、抗肾上腺素、游离基清除剂、停止剂、抗炎药(降低中性白细胞活性)、代谢剂和可能的氧化氮供体在一优选实施例中，本发明提供了停止、保护和/或保存器官的方法，该方法包括给予有此需要的对象有效量的腺苷和局部麻醉剂合适的腺苷受体促效剂包括N6-环戊基腺苷(CPA)、N-乙基羧酰胺基腺苷(NEAC)、2-[p-(2-羧基乙基)苯乙基-氨基-5’-N-乙基羧酰胺基腺苷(CGS-21680)、2-氯腺苷、N6-[2-(3，5-二甲氧基苯基)-2-(2-甲氧基苯基)乙基腺苷、2-氯-N6-环戊基腺苷(CCPA)、N-(4-氨基苄基)-9-[5-(甲基羰基)-β-D-呋喃核糖基]-腺苷(AB-MECA)、([IS-[1a，2b，3b，4a(S*)]]-4-[7-[[2-(3-氯-2-噻吩基)-1-甲基-丙基]氨基]-3H-咪唑[4，5-b]吡啶基-3-基]环戊烷甲酰胺(AMP579)、N6-(R)-苯基异丙基腺苷(R-PLA)、氨基苯基乙基腺苷(APNEA)和环己基腺苷(CHA)局部麻醉剂可选自美西律、二苯海因、丙胺卡因、普鲁卡因、马比佛卡因、和1B类抗心律失常药如利多卡因或其衍生物(如QX-314)利多卡因是优选的，因为它能通过封阻钠快速通道、抑制代谢功能、降低游离胞液钙、防止细胞释放酶、可能保护内皮细胞和保护肌丝损伤，而作为局部麻醉剂利多卡因还能作为游离基清除剂和抗心律失常药因为利多卡因能封阻钠快速通道，可以理解其他钠通道封阻剂也可替代或与局部麻醉剂联用于本发明的方法和组合物中合适的钠通道封阻剂的例子包括毒物如河豚毒素所以，在本发明的一优选实施例中，提供了一种停止、保护和/或保存器官的方法，所述的方法包括给予有此需要的对象有效量的腺苷和利多卡因在另一优选实施例中，提供了药物或兽用组合物，其包括有效量的腺苷和利多卡因为易于参考，本文以下将“钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂”和“局部麻醉剂”称为“活性成分”本发明的方法包括给予有效量的活性成分，其时间和条件足以停止、保护和/或保存器官可以分开、顺序或同时给予单剂量或系列剂量的活性成分对象可以是人或动物，如家畜(如绵羊、母牛或马)、实验室试验用动物(如小鼠、兔或豚鼠)或宠物(如狗或猫)，尤其是那些有经济价值的动物可看出，按对象的特性、待停止、保护和/或保存的器官类型和提出的应用，来确定组合物中存在的活性成分的量对在心脏直视手术中需要停止心跳的人而言，腺苷的浓度宜为约0.001到20mM，较佳地约为0.01到10mM，更佳地约为0.05到5mM，利多卡因的浓度宜为约0.001到20mM，较佳地约为0.01到10mM，更佳地约为0.05到5mM对在心脏病发作或心血管介入性治疗之前、期间或之后需要治疗的人对象而言，下表列出了腺苷和利多卡因的优选浓度注射利多卡因的类型/单位腺苷位点静脉内灌输 1. 0.001-10 1. 0.0001-20mg/分钟/kg2. 0.01-52. 0.01-103. 0.01-13. 0.5-3静脉内快速注射 1. 0.0001-1001. 0.001-1000mg/kg 2. 0.001-10 2. 0.01-100冠状动脉内灌注 1. 0.0001-1001. 005-50mg/分钟 2. 0.001-1 2. 0.005-5(每个心脏)3. 0.01-0.5 3. 0.05-2.5冠状动脉内快速注射 1. 0.001-10001. 0.01-10,000μg 2. 0.1-100 2. 1-1000(每个心脏)3. 1-20 3. 10-2001＝较佳地2＝更佳地3＝最佳地可以任何适当的途径给予活性成分，包括口服、植入、直肠、吸入或吹入(通过嘴或鼻)、局部(包括颊和舌下)、阴道和肠道外(包括皮下、肌内、静脉内、胸骨内和皮内)较佳地，通过将活性成分与对象或有类似血型的对象的血液混合，实现心脏直视手术或心血管介入性治疗中的给药然后活性成分一般通过主动脉进入冠脉循环通过连续或间歇给药达到停止例如，在Langendorff模式通过主动脉逆行由连续或间歇灌注，发生心脏停止但可以看出最佳路径可因对象的病症和年龄和所选用的活性成分而改变本发明的组合物在约15℃-37℃是高效的，较佳地为约20℃到37℃，用St Thomas No.2溶液只当温度较低(如降到4℃)才可完成较长的停止时间当可以将一种或两种活性成分单独给予时，较佳地是将它们中的一种或两者与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂一起给予各种载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂必须与组合物中的其他成分是药学上“相容”的，且对对象无害这些组合物可常规地以单位剂量存在，且可用制药领域熟知的方法准备这些方法包括将活性成分与载体(由一种或多种副成分组成)混合较佳地，通过均匀地、精细地将活性成分与液态载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂混合来制备这些组合物本发明还涉及药物组合物或兽用组合物，包括活性成分和药学上或兽用可接受的载体、稀释剂、佐剂和/或赋形剂本发明的适用于口服的组合物可以为离散的单位，如胶囊、囊剂或片剂(各含有预定量的活性成分)、粉末或颗粒、溶液或悬浮液(在水性或非水性液体中)、或水包油的液态乳化剂或油包水液态乳化剂活性成分也可以丸剂、膏剂或糊剂的形式存在通过压制或压模(任选地与一种或多种副成分)制备片剂通过用适当的机器将呈自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分，且其任选地与结合剂(如预胶凝玉米粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石粉或硅胶)、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如硬脂酸镁、滑石粉或硅胶)、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(如羟基乙酸淀粉钠、交联聚乙烯吡啶酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合，来制备压制的片剂可以用适当的机器将用惰性液态稀释剂润湿的粉末状化合物压制制得模制片剂这些片剂可任选地涂层或压刻，且可将其制备成能提供缓慢或受控地释放其中的活性成分，如利用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供理想的释放特性片剂还可任选地具有肠溶衣，从而在胃以外的肠道部分释放在停止、保护和/或保存器官前给予的液态制备物可以是如溶液、糖浆或悬浮液的形式或它们也可以是在使用前需与水或其他适当载体混合的干产品可用药学上可接受的添加剂如悬浮剂(如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化的可食脂肪)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯树胶)、非水性载体(如扁桃油、油酯、酒精或分级的植物油)、防腐剂(如对羟基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯)和能源(如碳水化合物如葡萄糖、脂肪如棕榈酸酯或氨基酸)，通过常规的方法制备这些液态制备物适用于在嘴中局部给药的组合物包括锭剂(含有可口基质通常为蔗糖和阿拉伯树胶或黄蓍胶的活性成分)、软锭剂(含有在惰性基质如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯树胶的活性成分)和漱口水(含有在适当液态载体中的活性成分)对皮肤上的局部应用而言，活性成分可以乳膏、油膏、凝胶、溶液或悬浮液的形式对眼睛的局部给药而言，活性成分可以是在适当的无菌水性或非水性载体中的溶液或悬浮液的形式另外，缓冲剂包括杀菌剂和杀真菌剂的防腐剂，如乙酸苯汞或硝酸盐、苯扎氯铵或双氯苯双胍己烷(chlorohexidine)和增稠剂如羟丙甲纤维素(hypromellose)也可加入还可将活性成分制备成储备制剂通过植入(如皮下或肌内)或肌内注射，可给予这些持久作用的制剂所以，可将活性成分与适当的聚合物或疏水材料一起制备(如在可接受的油或离子交换树脂中的乳剂，或溶解性较差的衍生物，如难溶的盐)直肠给予的制剂可以是与适当的非刺激性赋形剂混合的栓剂或保留灌肠剂，所述的赋形剂在常温时是固体，在直肠温度中则为液体，从而在直肠中融化释放出活性成分这些赋形剂包括可可豆油或水杨酸酯对鼻内和肺部给药而言，可将活性成分制备成通过适当计量装置或单位剂量装置给予的溶液或悬浮液，或任选地与适当的给药载体混合的粉末，用适当的送递装置给药对用于阴道给药的组合物而言，可以是阴道环、填塞物、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂，它们除活性成分外还含有本领域已知的那些载体适用于肠道外给药的组合物包括水性或非水性等渗无菌注射液，含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和维持组合物在接受对象的血液中等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，包括悬浮剂和增稠剂这些组合物还可装在单位剂量或多剂量的密封容器中，如安培和小瓶，且还可在冷冻干燥(冻干)条件下保存(仅需要在使用前立即添加无菌液态载体如注射用水)还可从上述的无菌粉末、颗粒和片剂制备即用的注射溶液和悬浮液当组合物是兽用时，可用该领域的常规方法制备这些兽用组合物的例子包括那些适用于(a)口服、外用的，如兽用顿服药(如水性或非水性溶液或悬浮液)；片剂或丸剂；与饲料混合用的粉末、颗粒或药丸；用于舌的贴片；(b)肠道外的给药，如通过皮下、肌内或静脉内注射，如无菌水或悬浮液；或(当适合时)通过乳房内注射，通过通过乳头将悬浮液或溶液引入乳房；(c)局部给药，如用于皮肤的乳膏、油膏或喷雾剂；或(d)阴道内，如阴道环、乳膏或泡沫可以看出除上述提到的成分外，本发明的组合物还可含有其他本领域常用的试剂(取决于所述的组合物)，例如那些用于口服的组合物还可含有结合剂、甜味剂、增稠剂、香料、崩解剂、涂层、防腐剂、润滑剂和/或延迟剂合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、天冬苯丙二肽酯或糖精合适的崩解剂包括玉米粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、黄原胶、皂土、海藻酸或琼脂合适的香精包括薄荷油、鹿蹄草油、樱桃、柑橘或树莓香精适当的涂层包括丙烯酸和/或异丁烯酸和/或它们酯的聚合物或共聚物、石蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、紫胶或谷蛋白适当的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素E、α-生育酚、维生素C、羟苯甲酸甲酯、羟苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠适当的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉适当的延迟时间的试剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯一优选的药学上可接受的载体是pH约为6-9的缓冲液，较佳地pH约为7，更佳地pH约为7.4，和/或低浓度的钾如至多约10mM，较佳地为约2-8mM，更佳地约为4-6mM合适的缓冲液包括Krebs-Henseleit(其通常含有10mM葡萄糖、117mMNaCl、5.9mM KCl、25mM NaHCO3、1.2mM NaH2PO4、1.12mMCaCl2(游离Ca2+＝1.07mM)和0.512mM MgCl2+(游离Mg2+＝0.5mM))、St.Thomas No.2溶液、Tyrodes溶液(其通常含有10mM葡萄糖、126mM NaCl、5.4mM KCl、1mM CaCl2、1mM MgCl2、0.33mM NaH2PO4和10mM HEPES(N-[2-羟基乙基]哌嗪-N’-[2-乙基磺酸])、Fremes溶液、Hartmanns溶液(其通常含有129NaCl、5mM KCl、2mMCaCl2和29mM乳酸盐)和Ringers-Lactate用低钾的一个优点是使本发明的组合物对对象的伤害较少，尤其是那些儿科对象如新生儿/婴儿高钾与钙的积蓄有关，而钙的积蓄又与心脏损伤、细胞膨胀和恢复过程中的心律失常相联在心脏停止中新生儿/婴儿比成年人更易受高钾的损伤缺陷手术后，新生儿/婴儿的心脏可能需要许多天才能恢复正常，有时需要加强治疗或生命维持所以使用低浓度镁的载体是有利的，如低于约2.5mM，但可以看出需要时而且对组合物的活性基本没有影响，也可使用高浓度镁(如高达约20mM)在本发明的另一实施例中，提供了一种药物组合物或兽用组合物，包括腺苷、利多卡因和药学上可接受的载体(其含有至多约10mM的钾)在另一优选实施例中，本发明提供了药物组合物或兽用组合物，包括腺苷、利多卡因和Krebs-Henseleit缓冲液组合物还可便利地以试剂盒的形式存在，将活性成分分开安置，以分开、顺序或同时给予可以看出本发明的组合物还包括和/或与已知的药物联用，这取决于所需的应用例如，对用于基本预防血液中腺苷降解的药物如核苷转运抑制剂如双嘧达莫，可作为本发明组合物的添加剂腺苷在血液中的半衰期约为10秒，所以存在防止其降解的药物能将本发明的组合物的效果最大化较佳地含有的双嘧达莫的浓度范围约为0.1nM到10mM，且对保护心脏非常有利通过抑制腺苷转运(增加血管舒张)双嘧达莫可以辅助腺苷的作用当组合物是间歇给予时这尤其重要药物的其他例子包括凝块破裂药如链激酶如上所述，可在给予患着或正发展成心脏病的对象链激酶的同时给予组合物本发明还参考以下实施例进行了描述这些实施例不构成任何限制在实施例中，可以参考以下附图

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专利名称：器官的停止、保护和保存的制作方法图1是比较用Krebs-Henseleit配的100μM腺苷和0.5mM利多卡因与St.Thomas Hospital No.2溶液进行的心脏停止的主动脉流与时间的图；图2六张图显示30分钟间歇缺血后心率、心收缩压、主动脉流、冠脉流、MV02和心率压力乘积；图3六张图显示2小时间歇缺血后心率、心收缩压、主动脉流、冠脉流、MV02和心率压力乘积；图4六张图显示4小时歇缺血后心率、心收缩压、主动脉流、冠脉流、MV02和心率压力乘积；图5图2-图4结果总结的柱状图；图6六张图显示用新生儿心脏进行2小时歇缺血后心率、心收缩压、主动脉流、冠脉流、MV02和心率压力乘积；图7四张图显示冠状动脉结扎后(无腺苷-利多卡因灌注)体内大鼠心脏20分钟缺血。图8四张图显示冠状动脉结扎后体内大鼠心脏20分钟缺血，用腺苷(6.3mg/ml)和利多卡因(12.6mg/ml)以1ml/小时/300g大鼠的速率灌注；图9显示冠状动脉结扎后体内大鼠心脏30分钟缺血，用腺苷(6.3mg/ml)和利多卡因(12.6mg/ml)以1ml/小时/300g大鼠的速率灌注；图10四张图显示冠状动脉结扎后体内大鼠心脏20分钟缺血，用腺苷(3.15mg/ml)和利多卡因(12.6mg/ml)以1ml/小时/300g大鼠的速率灌注；图11四张图显示冠状动脉结扎后体内大鼠心脏30分钟缺血，用腺苷(1.6mg/ml)和利多卡因(12.6mg/ml)以1ml/小时/300g大鼠的速率灌注；图12显示冠状动脉结扎后体内大鼠心脏30分钟缺血，用腺苷(1.6mg/ml)和利多卡因(12.6mg/ml)以1ml/小时/300g大鼠的速率灌注；图13两张图显示用和不用AL在体内心脏病的发病过程中ATp和PCr相对于缺血时间的变化；图14两张图显示用和不用AL在体内心脏病的发病过程中乳酸盐和心肌pH相对于缺血时间的变化；图15两张图显示用和不用AL在体内心脏病的发病过程中糖原和心率压力乘积相对于缺血时间的变化；在实施例中，“AL”指含有腺苷和利多卡因的组合物。实施例1本实施例比较了腺苷(100μM)心麻痹剂与高钾St.Thomas Hospital No.2溶液(16mM K+)对连续灌注全程缺血后的功能性恢复的影响。37℃用Krebs-Henseleit pH7.4缓冲液以工作模式(预负荷7.5mmHg；后负荷100mmHg)灌注雄性450g Sprague-Dawley大鼠的心脏(n＝19)30分钟。然后在70mmHg恒压的逆行模式，用(i)含有100μM腺苷和0.5mM利多卡因的过滤的Krebs-Henseleit(10mM葡萄糖，pH7.6-7.8在37℃)(n＝11)的溶液或(ii)St.Thomas No.2溶液(0.2微米过滤)(n＝8)使心脏停止。停止30分钟或4小时后，恢复用37℃ Krebs-Henseleit pH7.4进行正常的顺行灌注心脏。监测心率、冠脉流、主动脉流、主动脉压和耗氧。用Student t-测试测得统计学差异。结果与St.Thomas No.2溶液相比，用腺苷心麻痹进行心脏停止30分钟达到静止状态只要一半时间(77秒与33秒，p＜0.0001)。在恒定的灌注压下进行停止，用腺苷心麻痹剂冠脉血流要大30％(p＜0.05)。在再灌注过程中发现AL心脏的主动脉压、主动脉流和心排血量较快恢复。再灌注后5分钟，AL心脏的心率、主动脉压、主动脉流、冠脉流、心排血量和氧耗都较高(表1)。在100mmHg灌注压(perfusion head)15、25和35分钟后也发现较高的主动脉流(图1)。表130分钟连续停止体温正常的工作大鼠心脏后，比较腺苷和利多卡因心麻痹剂与St Thomas No.2 Hospital溶液(37℃)腺苷和利多卡因(n＝11) Thomas No.2溶液(n＝12)电动停止(秒) 30±2秒 77±6秒参数对照 5分钟恢复％对照对照 5分钟恢复％对照心脏(bpm) 292±9213±8 73％ 285±14 150±35 53％心收缩压(mmHg) 122±3126±4 103％126±388±14 70％*舒张压(mmHg) 76±1 74±1.397％ 78.5±1.2 59±8.5 75％主动脉流(ml/分钟) 35.6±3 24±4 67％ 31.5±4.1 9.96±2.832％*冠脉流(ml/分钟)16.4±0.7 13.6±0.9 83％ 17.4±0.7410±1.9 57％心排血量(ml/分钟) 52±3 37.2±4.7 72％ 50±4 20±4.5 40％*氧耗(μmol/分钟/湿重) 6.97±0.285.39±0.38 77％ 7.28±0.304.14±0.557％在30分钟停止流程前5分钟采集取对照值。*显著P＜0.05由功能性参数来看，与St.Thomas Hospital No.2溶液相比，100μM和0.5mM利多卡因心麻痹剂引导较短的停止时间和提高的恢复特性。下表2列出了4小时心脏停止的结果。表2比较S-D大鼠心脏用腺苷/利多卡因心脏麻痹剂进行或St Thomas Hospital溶液No.2进行连续心脏麻痹30分钟后的功能性恢复稳定灌注过程n 心率心收缩压冠脉流主动脉流心排血量 MV02停止(bpm) (mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7 292.18 122.38 16.44 35.66 526.97 在70mmHg稳+利多卡因 ±8.82 ±3.58 ±1.07 ±3.33 ±2.73±0.28 定灌注压力送心麻痹％100100100 100 100 100 递进行30分St Thomas102.85 128.08 17.431.53 48.93 7.28 钟心脏停止Hosptial ±13.48±3.14 ±0.74 ±4.09 ±4.15±0.3No.2溶液％100 100 100 100 100 100表2续再灌注后5分钟n心率心收缩压冠脉流主动脉流心排血量 MV02(bpm) (mmHg)(ml/分钟)(ml/分钟)(ml/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7212.91126.09 13.6 23.6437.24 5.39+利多卡因 ±7.62±4.15 ±0.92 ±4.09 ±4.73±0.38心麻痹剂％ 73103 83 66 7277St Thomas10 150.3688.08 10.099.96 20.06 4.14Hospital ±34.45 ±14.21 ±1.93 ±2.83 ±4.49±0.5No.2溶液％5370 57 32 4057再灌注后15分钟n 心率心收缩压冠脉流主动脉流心排血量MV02(bpm) (mmHg)(ml/分钟)(ml/分钟)(ml/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7 262.18 114.9112.5525.0737.82 5.89+利多卡因 ±10.36±4.18±1.03 ±3.08 ±3.89 ±0.32心麻痹剂％90 9476 71 72 86St Thomas10257.09 118.8215.0516.1831.24 6.1Hospital ±14.81±3.81±1.24 ±2.95 ±3.73 ±0.45No.2溶液％90 9486 51 64 84表2续再灌注后25分钟n 心率心收缩压冠脉流主动脉流心排血量MV02(bpm) (mmHg)(ml/分钟)(ml/分钟)(ml/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7 253.54 118.4 14.08 30.5244.8 8.06+利多卡因 ±28.47±3.58 ±0.75±2.73 ±3 ±0.31心麻痹剂％ 8797 8686 8687St Thomas10 266.91 118.09 15.05 23.1138.16 6.6Hospital±15.16±3.43 ±1.04±3.94 ±4.47±0.48No.2溶液％ 9494 8673 7891再灌注后35分钟n 心率心收缩压冠脉流主动脉流心排血量MV02(bpm) (mmHg)(ml/分钟) (ml/分钟)(ml/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷7 283.83 118.88 14.2 32.1346.33 6.54+利多卡因 ±11.74±4.62 ±0.68±2.94 ±3.43±0.09心麻痹剂％97 97 8890 8994St Thomas 10271.27 120.45 15.38 25.3540.74 6.74Hospital ±14.04±3.11 ±1.37±4.03 ±4.4 ±0.48No.2溶液％96 96 8880 8996实施例2用实施例2所述的方法制备成年Wistar大鼠(350g)，然后进行以下的间歇灌注。在将心脏从工作模式回到成Lagndorff模式后，在70mmHg的恒压下进行间歇逆行灌注。稳定后，用50ml腺苷加利多卡因心麻痹剂或St Thomas HospitalNo.2溶液使心脏停止。然后交叉夹住主动脉，让心脏停止20分钟(除30分钟间歇停止流程中)，然后解除夹子，自70mmHg压头送递停止溶液2分钟。再安置夹子，连续进行此流程30分钟、2小时和4小时(37℃)。
与实施例1的连续灌注相反，间歇心麻痹送递是临床上常用的方法。在间歇停止过程中，夹住对象的主动脉，然后给予停止溶液。几分钟后，心脏停止，停止心麻痹送递。心脏保持不动可进行手术。每30分钟给予停止溶液几分钟，从而维持心脏的停止状态以保留和保护心肌。在这些时间过程中，由乳酸盐的产生和心肌pH的下降表明心肌慢慢地变得缺血。由此，间歇灌注送递通常被称为间歇缺血停止。下表3-7和图2-5显示这些结果。
37℃缺血停止30分钟表3和图2显示AL的停止时间是St Thomas溶液的一半，21s(n＝7)与53s(n＝10)。在重灌注后所有心脏的功能都恢复到相同水平(组间没有明显差异)。
表3用腺苷/利多卡因心麻痹剂和St Thomas Hospital溶液No.2进行成年心脏30分钟间歇停止*的特征*(15分钟后的主动脉夹制后，有节奏地重复2分钟心麻痹)腺苷/利多卡因心 St Thomas Hospital P麻痹剂(n＝7) 溶液No.2(n＝10)停止时间(秒) 21.4352.78 p＜0.01±3.92 ±5.65首次收缩时间 147.14 133.67 ns重灌注后(秒) ±14.95 ±31.44恢复到100mmHg的时间 302.14 309.44 ns±21.87 ±30.15表4比较用腺苷/利多卡因心脏麻痹剂或St Thomas Hospital溶液No.2进行间歇缺血*30分钟后大鼠心脏的功能性恢复稳定灌注过程n心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02 停止(bpm) (mmHg)(ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡 7254.38128.23 34.33 21.64 58.29 31504±1651 6.31 在15分钟因心麻痹剂±11.01 ±2.83 ±3.64 ±2.02±4.63 ±0.65 送递心麻St Thomas10 276.74123.64 32.78 19.38 55.36 34090 5.97 痹剂进行Hosptial ±11.87 ±1.30 ±2.09 ±1.62±2.59 ±1111 ±0.56 30分钟缺No.2溶液 100 100 100100 100 100 100血停止表4续再灌注后5分钟n 心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm)(mmHg)(ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷7 180.48 132.79 22.06*22.15 47.5924074 6.81+利多卡因 ±26.83 ±6.65 ±4.48 ±2.20 ±2.70 ±3330 ±0.97心麻痹剂74 10464 102 82 76 108St Thomas 10 135.94 81.82 19.04*13.48 34.6123281 5.02Hospital±32.71 ±15.94±4.69 ±2.47 ±6.96 ±4069 ±0.79No.2溶液49 58 70 636884*用Students T测验的统计学显著差异(n＜0.05)表4续再灌注后15分钟n心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02 停止(bpm)(mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7225.31 126.1729.21 17.14 48.9928228 5.03+利多卡因 ±19.17 ±2.88±3.20 ±1.81 ±3.76 ±2015 ±0.49心麻痹剂92 9885 79 84 90 80St Thomas 10 255.88 121.5624.84 17.00 45.0731131 5.41Hospital±9.69 ±1.32±2.36 ±1.64 ±2.47 ±1267 ±0.53No.2溶液92 9876 88 81 91 91表4续再灌注后30分钟n 心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm) (mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟)(ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7236.94124.8429.60 16.4949.09 29403 5.42+利多卡因 ±13.75 ±2.61±2.83 ±1.51 ±1.95 ±1231 ±0.70心麻痹剂979786 76 84 93 86St Thomas 10 255.17122.1622.26 17.0842.41 31154 5.26Hospital±12.29 ±1.62±3.32 ±1.20 ±3.28 ±1464 ±0.38No.2溶液929968 88 77 91 88再灌注后60分钟n心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm) (mmHg)(ml/分钟)(ml/分钟)(ml/分钟)(mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 7244.97119.80 22.42 15.52 41.53292695.25+利多卡因 ±11.48 ±2.95 ±3.48 ±0.49±2.78 ±1240 ±0.55心麻痹剂100 93 65 7271 93 83St Thomas 10 258.16117.57 17.01 15.46 35.89303925.08Hospital±13.88 ±1.68 ±3.08 ±1.21±3.46 ±1727 ±0.33No.2溶液9395 52 8065 89 85
37℃缺血停止2小时表5和图3显示A-L停止的时间是St Thomas溶液的一半，33s(n＝7)与81s(n＝8)。用St Thomas停止的8只心脏中有4只不能恢复。所有A-L心脏都存活(n＝7)。恢复的St Thomas心脏的主动脉流为50-90％，心率70-120％和心收缩压90-100％恢复。恢复的A-L心脏的主动脉流80％、心率95％和心收缩压95-100％恢复。
表5用腺苷/利多卡因心麻痹剂和St Thomas Hospital溶液No.2进行成年大鼠心脏缺血停止*2小时的特性(*20分钟主动脉夹制后，有节奏地重复2分钟心麻痹)n腺苷/利多卡 n St Thomas Hospital p因心麻痹剂溶液No.2停止时间(秒)7 338 810.0003±5 ±8重灌注后的第一次收 7 360±19 4 260±95 NS缩的时间(秒)恢复到100mmHg的 7 541±46 4 2400±3261 NS时间和得到主动脉流的时间(秒)心脏重灌注后存活的 100 50百分比
37℃缺血停止4小时表6和7及图4显示A-L停止的时间是St Thomas溶液的一半，26s(n＝9)与78s(n＝7)。用St Thomas停止的7只心脏中有6只不能恢复。所有A-L心脏都存活(n＝9)。唯一恢复的St Thomas心脏的主动脉流为40％，心率80％和心收缩压90％恢复。恢复的A-L心脏的主动脉流70％、心率90％和心收缩压95-100％恢复。
表6用腺苷/利多卡因心麻痹剂和St Thomas Hospital溶液No.2进行成年大鼠心脏缺血停止*4小时的特性(*20分钟主动脉夹制后，有节奏地重复2分钟心麻痹)腺苷/利多卡 St Thomas Hospital p因心麻痹剂溶液No.2停止时间(秒) 26.44 77.86 ＜0.001±2.77 ±10(n＝9) (n＝7)重灌注后的第一次收 401.67 390.00缩的时间(秒) 28.48 (n＝1)(n＝9)恢复到100mmHg的 549.22 480.00时间和得到主动脉流 40.68 (n＝1)的时间(秒) (n＝9)心脏重灌注后存活的 100 14 ＜百分比 (n＝9) (n＝1) 0.0001表7比较用腺苷/利多卡因心脏麻痹剂或St Thomas Hospital溶液No.2进行间歇心脏缺血性停止4小时后大鼠心脏的功能性恢复稳定灌注过程n 心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02停止(bpm) (mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡 9275.33118.44 36.47 16.28 53.88 32338 6.71 在每20分因心麻痹剂±12.91 ±3.50 ±1.65 ±1.03 ±1.73 ±1084 ±0.45 钟送递心St Thomas7259.21121.57 41.23 16.03 57.26 31508 7.64 麻痹剂进Hosptial ±12.84 ±2.42 ±4.18 ±1.26 ±5.30 ±1672 ±0.24 行4小时No.2溶液n＝1 270 117.00 51 19.8 70.8 315900 7.28 缺血停止表7续再灌注后15分钟n 心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm)(mmHg)(ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 9 229.89110.8919.81 13.92 36.4925327 5.94+利多卡因±16.10 ±1.86±3.56 ±1.53 ±4.13 ±1555 ±0.69心麻痹剂％83 9454 86 68 78 89St Thomas 1 220.00100 18.60 16.20 36.4022000 5.303Hospital ％81 8536 82 51 70 73No.2溶液再灌注后30分钟n心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm) (mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 9239.444113.0024.62 11.5339.4426684 4.946+利多卡因 ±18.7165 ±3.07±2.917±1.001 ±4.259 ±1669 ±0.443心麻痹剂％87 9568 71 73 83 74St Thomas 1220105.0016.8 20.4 39.2 23100 5.303Hospital％81 9033 103 55 73 73No.2溶液表7续再灌注后60分钟n 心率心收缩压主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm)(mmHg) (ml/分钟) (ml/分钟)(ml/分钟)(mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷 9 249.22 111.89 25.58 11.3940.63 275705.04+利多卡因±17.19 ±3.29 ±3.26 ±1.32 ±4.72±1577 ±0.49心麻痹剂％91 94 70 70 7585 75St Thomas 1 250.00 102.00 14.40 18.0034.40 255006.29Hospital ％93 87 28 91 4981 86No.2溶液图5是图2-4结果的总结，显示在30分钟缺血间歇停止(n＝7)、2小时缺血间歇停止(n＝7)和4小时缺血间歇停止(n＝9)后，用AL溶液停止的心脏全部存活。相反，用St Thomas溶液停止的心脏，30分钟后全部(n＝10)存活，50％(8只测试的心脏中有4只)和14％(7只测试的心脏中有1只)存活。另外，成功地用AL停止两只心脏达6小时。
图2-4显示0.5小时停止(图2)、2小时停止(图3)和4小时停止(图4)后的60分钟过程中的功能特性(心率、心收缩压、主动脉流、冠脉流、氧耗和心率-压力乘积)。在所有实验中，用AL溶液进行心脏停止的功能性恢复参数较高。0.5小时停止后，除接受AL停止溶液的心脏主动脉流恢复外，这些差异都不明显。30分钟时70mmHg压头下的主动脉流恢复到对照的90％，而相比之下St Thomas心脏只有65％。2小时间歇缺血停止后功能性恢复的差异就更大。AL停止的心脏心率和心收缩压恢复到几近对照值的100％，而St.Thomas心脏仅恢复40-50％。AL心脏中主动脉流、冠脉流、氧耗和心率-压力乘积恢复到对照的80％和更高，St Thomas心脏仅为20-40％。4小时停止后，差异就更大了，7只StThomas心脏只有1只恢复。而所有AL心脏在4小时停止后，都恢复到上述2小时停止的功能性参数。可以得到如下结论AL停止在2和4小时停止过程中提供对成年心脏的优良保护和恢复。
实施例3用实施例2所述的方法，37℃用间歇灌注方法制备新生/幼大鼠(用50-70g 20天龄的大鼠)心脏2小时，但将送递和后负荷的压头减至50mmHg。下表8和9及图6列出的结果显示显示A-L停止的时间是St Thomas溶液的三分之一，19s(n＝7)与66s(n＝7)。用St Thomas停止的7只心脏中有3只不能恢复。所有A-L心脏都存活(n＝7)，恢复80％主动脉流。恢复的St Thomas心脏恢复到平均80％主动脉流速，但变异非常大。
所有用AL溶液停止的新生/幼大鼠心脏都在2小时间歇缺血停止后恢复。而用St Thomas溶液停止的7只心脏在2小时间歇缺血停止后只有4只恢复。在AL停止心脏中，心率和心收缩压恢复到对照值的90-100％，而St Thomas心脏仅恢复50-60％。AL心脏的主动脉流、冠脉流和心率-压力乘积恢复到对照的80％及更高，而St Thomas心脏仅约50％。AL心脏的氧耗为对照的70-85％，而St Thomas溶液进行的心脏停止仅为约60％。可以得出如下结论在新生/幼大鼠心脏的2小时停止和恢复过程中AL能提供优良的保护。
表8用腺苷/利多卡因心麻痹剂和St Thomas Hospital溶液No.2进行新生未成熟大鼠心脏的停止*的特性(*20分钟主动脉夹制后，有节奏地重复2分钟心麻痹)重灌注后负荷50mmHg腺苷/利多卡 St Thomas Hospital p因心麻痹剂溶液No.2停止时间(秒) 18.57 65.71*＜0.05±3.27(7) ±12.71(7)重灌注后的第一次收 23.83 55.75*＜0.05缩的时间(秒) ±3.03(7) ±12.97(4)恢复到100mmHg的165 270 ns时间和得到主动脉流 ±29.48(7) ±83.5(4)的时间(秒)心脏重灌注后存活的 100(7) 57*(4) ＜0.05百分比心律失常发生率(％) 14(7) 25(4)ns*用Student t测验显示统计学差异p＜0.05表9比较用腺苷/利多卡因心脏麻痹剂或St Thomas Hospital溶液No.2进行缺血*停止2小时后未成熟大鼠心脏的功能性恢复*(20分钟主动脉夹制后，有节奏地重复2分钟心麻痹)稳定灌注过程n心率主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02 停止(bpm) (ml/分钟)(ml/分钟) (ml/分钟)(mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡 7261.98 6.99 4.8013.45*16579 4.60每20分钟送递心因心麻痹剂±12.81 ±1.30 ±0.56 ±1.16±853 ±0.52 麻痹剂2分钟进行St Thomas7239.96 4.43 4.299.95*15515 5.392小时缺血停止Hosptial ±19.52 ±1.05 ±0.76 ±1.01±1149±0.61No.2溶液表9续再灌注后15分钟n 心率主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm) (ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡因心麻痹剂 7 230.94 5.37 4.0311.77 14046 4.71±12.33±1.63 ±0.61 ±1.84±1297±0.33St Thomas Hospital 4 233.45 3.78 4.58 10.87 13818 4.36No.2溶液 ±36.2 ±1.51 ±1.2 ±1.99±3103±0.67再灌注后30分钟n心率主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm)(ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡因心麻痹剂 7235.39 6.67 4.09 12.45 14994 4.43±8.99 ±1.58±0.68 ±1.71 ±709 ±0.24St Thomas Hospital 4228.55 4.38 4.00 10.63 13522 4.14No.2溶液±32.67±1.68±1.14 ±1.97 ±2912 ±0.69再灌注后60分钟n心率主动脉流冠脉流心排血量 RP乘积 MV02(bpm)(ml/分钟) (ml/分钟) (ml/分钟) (mmHg/分钟) (μmol/分钟/g)腺苷+利多卡因心麻痹剂 7242.78 6 3.75 13.05 13272 4.13±30.35±1.66±0.57 ±1.55 ±2643 ±0.62St Thomas Hospital 4234.48 3.88 3.58 9.6813910 4.02No.2溶液±40.16±1.41±0.92 ±1.50 ±3262 ±0.75
实施例4下表10显示腺苷和利多卡因对1-2天龄的新生猪心脏的心麻痹有效。(每20分钟主动脉夹制间给予2分钟心麻痹剂脉冲共2小时)。
表10
实施例5将雄性Wistar大鼠(250g)关养在控温和控光的房间。提供充足的食物和水，直至实验前1天，停止供食，让大鼠饥饿过夜。腹腔内注射戊巴比妥(60mg/kg)麻醉大鼠。麻醉下，分别将导管植入大鼠的股静脉和动脉，用于腺苷和利多卡因(AL)给药，并分别测定血压。将大鼠气管切开，让大鼠人工呼吸每分钟60-70次室内空气。将大鼠的胸部切开，固定左前降(LAD)冠状动脉。将缝线置于LAD的下侧。基线20分钟后，捆扎实验大鼠组的LAD 30分钟，监测血压和心率。缺血30分钟后，松开夹子再灌输心脏20分钟。在对照大鼠，图7显示了没有给予AL。对灌注AL的3只大鼠，分别给予三种不同剂量的腺苷(1)如图8和9所示，6.3mg/ml腺苷+12.6mg/ml利多卡因，以1ml/小时/300g大鼠速率灌注；(2)如图10所示，3.15mg/ml腺苷+12.6mg/ml利多卡因，以1ml/小时/300g大鼠速率灌注；(3)如图11和12所示，1.6mg/ml腺苷+12.6mg/ml利多卡因，以1ml/小时/300g大鼠灌注。
与30分钟缺血(无AL灌注)的大鼠相比，发现AL以剂量依赖性形式保护心脏，在较高的剂量达到最大保护。如果腺苷的剂量减半则保护将逐渐失去。但即使在最差的状况，心脏的功能也比无AL的要好。所有接受AL大鼠的心脏心率和压力都恢复。
体内心脏病过程中腺苷和利多卡因的综述在心脏病发作或心肌梗塞(MI)30分钟的大鼠模型中，图7显示10分钟血压达到0，可将动物视为接近死亡。10分钟，心脏恢复而且血压上升，高度漂移由于缺血损伤。这种恢复可能是由于侧支循环的补充。相反，在夹制冠状动脉前5分钟，将腺苷和利多卡因溶液灌注入大鼠，则10分钟中没有观察到血压的这种下跌(图8)。而没有接受AL溶液的大鼠都接近死亡，存在AL溶液时心脏降低了其收缩的速率且仅错过少许心跳。值得注意的是，缺血20分钟时心跳没有紊乱。AL灌注停止后所有心脏都恢复其全部功能(图9)。可以得出如下结论在AL溶液中的心脏明显受到保护而对抗深度缺血发作(由关闭冠状动脉引发)。AL溶液对心脏的保护作用与腺苷的剂量相关。如果将腺苷的剂量减半而利多卡因的剂量不变，在10分钟和20分钟可以发现较大的变化(图10)。如果再将腺苷的剂量减半，保护进一步减少。但在所有实验中AL灌注的大鼠都完全恢复血液动力学功能(基于血压和心率)(图12)。
将两组有或无AL的经历心脏病发作的大鼠置于核磁共振(NMR)波谱仪中，图13-15记录了代谢数据。NMR非侵害性地测定了闭合冠状动脉的30分钟过程中三磷酸腺苷(ATP)、磷酸肌酸(PCr)和pH的变化。在工作台上进行的分开实验中，在液氮温度将心脏冷冻夹制，对中性化合的组织酸提取液以酶学方法(测定通过)用分光光度计测定糖原和乳酸盐。从闭合冠状动脉灌注中接受AL溶液的心脏观察到主要的明显差异(P＜0.05)。AL心脏中ATP保持在90-100％对照值，而未接受AL的心脏为60％(图13)。这同样也在高能磷酸储备的PCr中可以看出，虽然未接受AL的心脏表现出更大的百分比下跌(减至20％闭合前的值)(图14)。在接受AL的心脏中，在缺血过程中乳酸盐(厌氧代谢的终产物)增加5倍，而未接受AL的心脏中乳酸盐增加20倍以上(图15)。这由心肌细胞pH的测定可以支持，在未接受AL溶液的心脏发现更大的pH下降(更多酸)。需要指出的是，在AL心脏的最初10分钟pH的下跌很少，表明存在AL时心肌细胞根据组织乳酸盐水平较低得到更好氧的支持。在前10分钟有和无AL的心脏所消耗的燃料糖原量类似，但AL心脏保持约60-70％闭合前的值(单独与缺血心脏相比)。由代谢数据可以看出接受AL的冠脉闭合的心脏比那些没有接受AL的心脏更需氧。糖原是各心脏的主要能量来源，但AL心脏优先地从线粒体氧化磷酸化(而不是产生乳酸)再生它们的ATP。这与上述血压和心率变化的功能性数据完全一致。
实施例6用Krebs-Henseleit(含有10mM葡萄糖，pH7.4)配制200μM和50μM局部麻醉剂丙胺卡因、普鲁卡因和甲哌卡因配制停止溶液。下表11列出的结果是在70mmHg用心麻痹剂持续灌注30分钟得到的。
表11腺苷+丙胺卡因腺苷+普鲁卡因腺苷+马比佛卡因停止时间 13秒21秒 10.5秒第一次心跳113 145036主动脉流恢复 312 3353405分钟AF％ 67％58％ 39％实施例7将松脂溶解于0.05％二甲基亚砜(DMSO)(200μM)、局部麻醉剂丙胺卡因、普鲁卡因、马比佛卡因和利多卡因(在Krebs-Henseleit溶液中)来制备停止溶液。如下表12所示，发现松脂不如腺苷有效。
表12松脂松脂松脂松脂+丙胺卡因+普鲁卡因+马比佛卡因 +利多卡因停止时间128 422041 149第一次心跳 215 120056 230主动脉流恢复810 450655 4455分钟AF％ 0％ 25％ 0％70％15分钟AF％ 38％ 57％ 36％71％实施例8添加ATP-钾通道封阻剂、格列苯脲(20μM)和腺苷及利多卡因，延迟的停止时间增加三倍，从26秒(AL)增至76-120秒(ALG)(n＝2)。存在格列苯脲时更慢的恢复时间和更低的主动脉流(42-53％)显示开启KATP通道作为AL所提供的停止和保护模式的重要性。从这些结果可以得出如下结论ATP-钾通道是腺苷和利多卡因引发停止应答的重要靶。
表13A/L+20μM格列苯脲(n＝2) 仅A/L(n＝5)停止时间 76-120秒 26秒第一次心跳 245-255(分钟秒)1分钟37秒主动脉流恢复时间500-730(分钟秒)3分钟51秒5分钟AF％ 42-53％ 84％

本发明涉及停止、保护和/或保存器官的方法,该方法包括给予有此需要的对象有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂。本发明还涉及停止、保护和/或保存器官的方法,该方法包括给予器官组合物,该组合物含有有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)器官的局部麻醉剂。本发明还提供了药物组合物或兽用组合物,其包括有效量的(i)钾通道开启剂或促效剂和/或腺苷受体促效剂和(ii)局部麻醉剂。

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