专利名称：一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol)是20世纪六七十年代从红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus L.)植物树皮中分离出来的一种天然的四环二萜类生物碱，其在治疗宫颈癌、乳腺癌、小细胞肺癌、黑素瘤和结肠癌等方面有显著的疗效。紫杉醇首先在太平洋短叶红豆杉的树皮和形成层中提取出来。按照目前的纯化技术，生产Ikg的紫杉醇大约需要10吨红豆杉树皮。这大约需要从2000到4000棵60-70年生的红豆杉中才能获得。据相关资料介绍，每年全球大约需要消耗250kg紫杉醇纯品。这需要从250万千克树皮或者75万棵红豆杉中提取才能满足这一市场的需要。随着对紫杉醇需求量的日益递增，目前仅仅从天 然的红豆杉林树体中提取分离紫杉醇的产量已经不能满足医药市场需要，加之大肆的开采使红豆杉自然资源日趋枯竭、红豆杉资源自然更新能力差、生长缓慢、濒危灭绝，各国政府已明文规定禁止砍伐野生红豆杉资源。因此紫杉醇其他途径的开发就显得极为重要，其中利用人工栽培的红豆杉中提取分离紫杉醇是目前获取紫杉醇及半合成前体的一条重要途径，这可以加强对红豆杉野生种质资源及其生态环境的保护。红豆杉种子具有较长的休眠期，采收后必须在低温下用湿沙层积贮藏，春季播种后，其发芽期可延至第二年，红豆杉种子的这种发芽特性严重影响了其种苗的生产。植物组织培养技术是一种不依赖于环境条件进行生产的技术，通过红豆杉种胚离体培养，即可以获得更多的红豆杉种苗，可以克服生产中种子萌发率不高的特性，也可以将种胚直接或者间接的诱导成细胞系生产紫杉醇。红豆杉种子中含有较多抑制种子萌发的物质。南方红豆杉种子中含有正庚酸、壬酸、乙酸等发芽抑制物质，其种皮、内种皮和胚乳的浸泡液对白菜种子发芽率和幼苗的生长、根生长均有抑制作用，并且与浸提液浓度呈正比(张艳杰等，南方红豆杉种子种发芽抑制物的研究，南京林业大学学报(自然科学版)，2007，4 (31) :51-58).成熟的种子较未成熟的种子萌发率高(Yang F, et al, In vitro embryo culture ofTaxus chinensis var. mairei, Journal of Anhui Normal University(NaturalScience), 2010, 3(33):262-269)。影响红豆杉种胚萌发的因素很多，除了遗传因素外，很多的环境因素如基本培养基种类、光照、环境温度、适当的预处理等。南方红豆杉种胚离体培养萌发率显著受培养基类型和光照的影响，在B5培养基上10小时的光周期种胚离体培养萌发率高达 96% (Yang F, et al, In vitro embryo culture of Taxus chinensis var. mairei,Journal of Anhui Normal University(Natural Science)，2010，3 (33):262-269)。云南红豆杉种胚离体培养萌发率在MS培养基上较高，达到80%左右，胚乳可以促进种胚的萌发，幼苗中紫杉醇含量低于成年树皮中紫杉醇的含量(赵沛基等，云南红豆杉离体胚的培养，植物生理学通讯，2003，4 (39) :327-330)。Hector等对短叶红豆杉种胚的离体研究表明White’ s和MS培养基可以再离体培养2周后获得70%左右的萌发率，低温贮藏可以显著降低短叶红豆杉种子的萌发(Hector EF, In vitro culture and precociousgermination of Taxus embryos, In Vitro Cell. Dev. Biol. ,1991，27P:139-142)。Chee对短叶红豆杉、东北红豆杉、欧洲红豆杉和欧洲红豆杉另一个品种成熟离体胚研究表明，B5培养基为其萌发的最佳基本培养基,外源BA在低浓度处理时对种胚萌发无显著的影响，但高浓度的 BA 抑制种胚的萌发(Chee PP, In Vitro Culture of Zygotic Embryosof Taxus Species, Hortscience, 1994，29 (6) : 695-697)。Zhiri 等利用流动的自来水冲洗短叶红豆杉的种子7天，在改良后的MS培养基上离体培养得到了 100%的萌发率(ZhiriA, et al, Factors affecting the in vitro rapid germination of Taxus embryos andthe evaluation of taxol content in the plantlets, Plant Cell, lissue and OrganCulture, 1994, 39:261-263)。Zarek将欧洲红豆杉种子在4°C条件下至少浸泡48h后,分离种胚在MS培养(附加5g/L活性炭)离体培养在黑暗条件下可获得100%的萌发率(Zarek M，A practical method for overcoming the dormancy of Taxus baccata isolated embryosunder in vitro conditions,In Vitro Cell. Dev. Biol. 2007, (43):623-630)。种胚的离体再生与增殖也受红豆杉种类、植物激素种类和浓度、培养条件等因素的影响。Wann等以欧洲短叶红豆杉成熟种胚为材料，在BLCG培养基上附加2mg/L的2，4-D和lmg/L的BA,6周后获得可连续培养的红豆杉胚状体细胞(Wann. Induction ofsomatic embryo genesis in Taxus, and the production of Taxane—ring containingalkaloids therefrom, US, Patent No. 5310672, 1994-3-10)。Chee 描述了一种短叶红豆杉种苗的方法，他将短叶红豆杉种胚接种在1/2B5培养(附加IOiiM BA) 14天后再转接到McCown’ s基本培养基上(附加I. 0%)的活性炭，大约有5%的外植体发生了体细胞体细胞胚胎(Chee PP, Organogenesis in Taxus brevifolia tissue cultures, Plant CellReports, 1995，14:560-565)。Chee于1996年再次建立了短叶红豆杉未成熟种胚体细胞胚月台发生途径(Chee, Plant regeneration from somatic embryos of Taxus brevifolia,Plant Cell Reports, 1996,16:184-187)。Majada等建立了欧洲红豆杉种胚离体培养的再生体系，他们将种胚离体接种到WP培养基上(附加22. 19mM的BAP，0. 5%的活性炭和2%的蔗糖)培养30天，在转接到无激素培养基上，总共70天后可见到再生从芽的出现(MajadaJP, One step more towards taxane production through enhanced Taxus propagation,Plant Cell Reports, 2000，19:825-830)。Datta等报道了西藏红豆杉的合子胚愈伤组织再生的研究报道，试验结果表明西藏红豆杉的种胚接种到Lloyd and McCown’ s基本培养基，并附加SH有机物、0. 5mg/L的BA、I. 0-2. 0mg/L的2，4-D或者NAA，2个月后将愈伤组织转接到1/2WPMSH培养基上并附加2. 5mg/L的BA，4个月后可以获得再生苗(Datta MM，etal,Organogenesis and plant regeneration in Taxus wallichiana(Zucc. ),Plant CellRep, 2006，25:11 - 18)。可见红豆杉的不同种类，以及处理方法，培养条件等的不同都是影响其种胚萌发的重要因素。目前为止，还没有关于快速，简便的种胚离体再生获取南方红豆杉种苗的方法报道。
本发明的目的在于提供一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，为快速打破南方红豆杉种子休眠，获取整齐一致的南方红豆杉种苗打下基础。本发明的目的是通过以下方式实现的。一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，其特征在于，包括以下步骤(I)种子种胚的剥离将南方红豆杉(Taxales chinensis var. mairei)种子从外种皮中剥离出来；(2)外植体消毒取步骤(I)得到的种子用70%的酒精和0. 1%的氯化汞表面消毒，再用无菌水清洗；(3)种子的预处理将步骤(2)得到的种子用无菌水浸泡1-5天； (4)种子合子胚的分离在无菌条件下剥取种子的合子胚或带部分胚乳组织的合子胚；(5)试管苗的诱导将步骤(4)剥离的合子胚或带部分胚乳组织的合子胚接种到试管苗诱导培养基上诱导试管苗；诱导培养基为BLCG培养基(该培养基配方见Wannet al., induction of somatic embryogenisis in taxus, and the production oftaxane-ring containing alkaloids therefrom, United States Patent, US005310672A)+活性炭5g/L+蔗糖20g/L+琼脂7g/L，培养基pH值5. 8 ;培养条件为经过30天的暗培养后转入14h光照,光照强度44001x和IOh暗培养的光周期条件下培养,温度均为24±1°C。所述步骤(I)中的南方红豆杉种子为当年生或者4°C保存1-2年的南方红豆杉种子。所述步骤(2)清洗消毒过程具体如下先将去除外种皮的种子放入无菌的容器中，在超净工作台内依次经70%酒精消毒90s和0. 1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用。所述步骤(3)种子预处理具体过程如下将去掉外种皮的种子经过步骤(2)的表面消毒处理后，用无菌的蒸馏水在室温条件下无菌密封浸泡1-5天。该发明具有以下优点(1)外植体采集时期集中，污染率极低；(2)相比现有的其他种类的红豆杉种子复杂的预处理过程，本发明针对南方红豆杉种子的预处理过程则简单的多，而且用静水处理可以大量节约水资源，并且适合大批量的种子处理；(3)通过一步培养可以获得整齐一致的南方红豆杉种苗；种子萌发率达到99. 9%。图I是采用本发明方法快速打破南方红豆杉种子休眠的过程，其中A.红豆杉种子及去种皮的种子；B.离体培养0天的红豆杉种胚；C.离体培养7天的红豆杉种胚；D.离体培养10天的红豆杉种胚；E.离体培养15天的红豆杉种胚；F.暗培养30天后转入14h光照和IOh暗培养的光周期条件下培养10天后的试管苗。

本发明公开了一种快速打破南方红豆杉种子休眠的方法。包括(1)种子外种皮剥离利用机械破壳，手工剥离外种皮；(2)外植体消毒依次经70%酒精消毒90s和0.1%氯化汞消毒12min，无菌水冲洗5次后备用；(3)种子预处理用无菌水密封常温浸种1-5天；(4)分离合子胚；(5)试管苗的离体培养将种胚接种到试管苗诱导培养基上，可以获得99.9%的种子萌发率。本发明提供了一种简便、快速打破南方红豆杉种子休眠的方法，为获取整齐一致的南方红豆杉种苗打下基础，能节省大量的人力、物力、提高劳动效率。