狐米草细胞工程苗大规模繁殖技术制作方法

钦佩, 佘建明, 蔡小宁, 谢民, 杨永华, 尹金来, 李宽钰

2001年5月23日

2000年9月12日

2000年9月12日

南京大学, 江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所, 江苏省沿海地区农业科学研究所

C12N5/04GK1296075SQ0011252

狐米 细胞工程 繁殖 大规模 技术

一、狐米草细胞工程苗快繁技术，其特征是利用狐米草种子和幼穗进行愈伤组织诱导培养，其技术体系为(1)添加2，4-D和IAA激素条件下由狐米草外植体(种子和幼穗)诱导愈伤组织；(2)在添加2，4-D、NAA、BA、CW等激素条件下，进行愈伤组织的继代培养；(3)在添加BA和IAA等激素条件下，诱导培养再生植株；(4)在添加IBA、KT和AC等激素条件下，培养出完整的(生根的)再生植株；二、狐米草再生苗扩繁技术，其特征是用权利要求一产出的优质狐米草试管苗转移至无土栽培苗床，间隔浇灌植物营养液和人工海水，无土栽培2-3个月，可达优质分蘖苗标准

本发明属于植物细胞工程技术领域我国拥有5亿多亩的盐土资源，其中3亿亩在海滩要开发各类盐土资源，引种耐盐经济植物，实施盐土农业具有战略意义狐米草(Spartina patens)是一种耐盐优质牧草，但由于结实率很低，种子萌发率也很低，难以大规模繁殖推广美国特拉华大学的盐生植物生物技术中心(HBC)对狐米草种子(未涉及幼穗和其他外植体)进行了组织培养诱导分化再生植株的研究，发表了一篇论文(Xianggan Li，et al.，1995.Plant regeneration from callus cultures of salt marsh hay，Spartina patens，and its cellular-based salt tolerance，Aquatic botany 51，1995，103-113)，叙述了其组培试验全过程和各阶段培养基的主要成分，未涉及实验室大规模生产再生苗的技术(如报道植株再生的频率和获得再生植株的数量)，更缺乏实验室外的苗床无土栽培扩繁和滩涂实施技术目前国内外尚无狐米草细胞工程苗大规模生产技术及滩涂引种的成套技术研究及相关专利的报道本发明的目的是运用本项发明技术大规模生产狐米草耐盐优质细胞工程苗，以克服该植物结实率低、种子萌发率也低，阻滞大规模繁殖推广的弊端，适应我国海岸带耐盐牧草引种开发的迫切需要，从而推动我国盐土农业的可持续发展本发明的技术方案是1.狐米草组培细胞工程苗快繁技术利用狐米草种子和幼穗进行愈伤组织诱导培养，通过激素调控，可使其愈伤组织诱导频率提高至60％～90％以上愈伤组织的继代培养是决定其能否顺利进入分化的关键通过调整改善光照、激素条件、琼脂类别、氮源和有机化合物等因子，在遏止愈伤组织的褐化方面取得了成功，促使其继代增殖的正常进行，从而获得绿色致密的胚性愈伤组织本项技术已建立了狐米草优质胚性细胞系，从绿色致密的胚性愈伤组织转入分化，植株再生频率为100％(平均一块愈伤组织可产生20多个再生植株)在以上研究的基础上，本项技术建立了狐米草组织培养再生苗的技术体系如下(1)在添加2，4-D和IAA激素条件下由狐米草外植体(种子和幼穗)诱导愈伤组织；(2)在添加2，4-D、NAA、BA、CW等激素条件下，进行愈伤组织的继代培养；(3)在添加BA和IAA等激素条件下，诱导培养再生植株；(4)在添加IBA、KT和AC等激素条件下，培养出完整的(生根的)再生植株；该体系技术性能稳定，试验重复性好，试管再生苗分蘖、丛生性状良好，优质试管再生苗年生产能力为100万株各培养阶段的培养基配方(激素配比)如下表狐米草组培各阶段的培养基配方 在试管苗生产过程中，各个培养阶段的基本培养基均为MS大量元素、微量元素，B5维生素，蔗糖3％，Gelrite或Phytagel 0.2％采用这一技术体系，种子发芽率从5％提高到50％以上；以种子为外植体材料，愈伤组织诱导率达57％以上，以幼穗为外植体，愈伤组织诱导率在90％以上；绿色颗粒状愈伤组织继代培养增殖周期为20天，增殖率为1∶8；绿色愈伤组织再生植株的频率达100％，平均每块愈伤组织分化植株4～5丛计20多株；试管苗的生根率达90％以上2.狐米草再生苗扩繁技术用上述优质试管苗转移至无土栽培苗床，配以疏松型培养基(宜采用锯木屑碳渣型培养基，二者体积比为10∶1)和海水性营养液，经2个月的育苗栽培，效果较好，幼苗成活率超过80％，扩繁倍数为20～30，根长超过30cm，完全达到耐盐优质苗水准这类优质苗引种到苏北盐城海岸带被海水浸润的滩涂，经10种生境条件的探索研究，立苗成活率可达80％狐米草无土栽培所用的营养液为海水性营养液，实际上是间隔浇灌植物营养液和人工海水植物营养液(改进的Hogland营养液)和人工海水配方如下表所示植物营养液配方 人工海水配方 狐米草细胞工程苗出瓶后经2个月以上的无土栽培，已达优质分蘖苗的标准，其株高在80～100cm，根长超过30cm，分蘖数也超过30，其增殖倍数为20～30运用本项技术出瓶的4000株细胞工程苗，经无土栽培共培育出60000株优质分蘖苗在盐城滩涂(大丰海丰农场自强养殖公司滩涂基地、射阳盐场送水道滩涂和大丰斗龙港等滩涂)进行了11次狐米草再生苗的引种栽培，共计60000株苗，建立了面积为10亩的以狐米草为代表的的盐土农业示范区引种栽培的成功与否取决于育苗的健壮(主要是根系)、狐米草生活习性的掌握和滩涂环境情况(具体种植情况如下表所示)表4不同条件下狐米草再生植株的引种栽培对比 本发明效果是采用这一技术体系，种子发芽率从5％提高到50％以上；以种子为外植体材料，愈伤组织诱导率达57％以上，以幼穗为外植体，愈伤组织诱导率在90％以上；绿色颗粒状愈伤组织继代培养增殖周期为20天，增殖率为1∶8；绿色愈伤组织再生植株的频率达100％，平均每块愈伤组织分化植株4～5丛计20多株；试管苗的生根率达90％以上狐米草细胞工程苗出瓶后经2个月以上的无土栽培，已达优质分蘖苗的标准，其株高在80～100cm，根长超过30cm，分蘖数也超过30，其增殖倍数为20～30通过体细胞胚的诱导培养研究，大规模生产狐米草的细胞工程苗，并用细胞工程等技术改良狐米草的农艺品质，以利于推广开发如有足够投资，用此技术方案，可年生产狐米草试管苗100万株，从而年产细胞工程苗2000万株以上这样，不仅每年从细胞工程苗可获直接经济收入200万元，而且可实现直接推广面积1000亩左右盐土农业非常适合我国的国情，有利于解决我国地少人多、食物和蛋白质短缺的问题，也可以缓解西部草场的生境压力因为海滩盐沼的光能利用率是温带草地的10倍；海滩盐沼植被的生产力是温带草原的10-15倍；开发海滩盐土非但不占良田，还可增加农业用地；因此，充分利用盐土和海水资源，大力开发耐盐耐海水优质牧草等植物资源，有望为我国的海洋产业创造巨大的新增效益