专利名称：一种用细胞工程技术获得的抗紫外线制剂的制作方法紫外线包括三个波段短波(UVC，200～280nm)、中波(UVB，280～320nm)和长波(UVA，320～400nm)紫外线，其中UVB和UVA可穿过大气层到达地面，对人体皮肤造成损伤，UVA穿透力极强，主要引起皮肤细胞DNA氧化性损伤而引起光老化；而UVB可引起皮肤细胞发生免疫抑制、炎症发生、DNA光加合物嘧啶二聚体形成，如对后者修复不善，可导致DNA突变及皮肤癌的发生；各种可以抵抗紫外线对细胞造成损伤的物质，特别是天然成分的分离、筛选已经成为医药、化妆品基础研发的热点，具有很高的实际应用价值。由于植物的不可移动性和对光的生理需求(如光合作用等)，因此植物发展了许多避免受到强烈紫外线对细胞造成损伤的机制，植物体中具有防止紫外线损伤的物质主要有有机酸类(如鞣酸、异阿魏酸、黄木樨酸苷等)、黄酮类、醌类、皂甙类(如柴胡皂甙、黄芩皂甙等)矿物质、粘蛋白、超氧化物歧化酶SOD、抗氧化剂(如维生素E、维生素C和β-胡萝卜素、原花青素(OPC)、表没食子儿茶酚没食子酸酯(EGCG)等)，它们或是对紫外线有较强的吸收，或是有抑制酪氨酸酶的活性作用，或是有清除紫外线辐射产生的自由基的作用，近年来许多试验室开展了在植物提取物中筛选紫外线吸收物质和抗氧化物质的工作，也取得了很好的进展，很多成分已经广为应用在医药、保健品和化妆品领域，例如OPC、EGCG等的开发应用已经取得巨大的经济效益。Larkin和Scowcroft把植物组织培养再生植株中出现的变异叫做体细胞无性系变异(somaclonal variation).近年来的研究表明，体细胞无性系变异是植物组织培养过程中出现的普遍现象，Veilleux和Johnsont将体细胞无性系分为5种类型染色体畸变、可转位因子的激活、DNA甲基化状态改变、基因点突变及表观遗传变异。对各种植物体细胞无性系变异株后代的分析也已经证明，其中绝大多数变异是可遗传的，在植物育种上广泛的应用前景已经得到公认。一般植物原生质体在5-20J/cm2紫外线(UVA+UVB)照射下，就会被杀死，已知柴胡皂甙具有明确的消炎、抗紫外线功能，柴胡细胞本身具有一定的抗紫外线伤害的能力，利用柴胡体细胞无性系变异筛选高抗紫外线的细胞克隆(能够耐受紫外线(UVA+UVB)47.5J/cm2)，为将来利用细胞工程技术生产抗紫外线制剂提供良好的工程细胞具有重要意义。参考文献1.张红霞，刘胜祥，郑小江等，具有防晒作用的植物资源初步研究，中国野生植物资源，2004，2315-202.张贵民，化妆品防晒剂的研究进展及其安全性问题，日用化学品科学，2003，26119-1263.韦彦余，赵民安，王晓军，植物体细胞无性系变异在植物性状改良中的应用，植物生理学通讯，2004，40763-7714.C.E.Mothersill，M.J.Moriarty，C.B.Seymour，Radiotherapy and the potentialexploitation of bystander effects，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，2004，58575-579. 5.G.J.Fisher，S.C Datta，H.S.Talwar，et al.，Molecular basis ofsun-induced premature skin ageing and retinold antagonism，Nature 1996，379335-3396.Schmidt M.W alz C.Hesemann CV.Somaclonal variation of the mitochondrialATPase subunit 6 gene region in regenerated triticak shoots and full-grownplants.Theor.Appl.Genet.，1996，93355~3607.Veilleux RE，Johnson AAT.Somaclonal variationmolecular analysis，transformation interaction and utilization.Plant Breed Rev.，1998，16229-269
本发明的目的在于将高抗紫外线的细胞克隆，在固体或液体培养基上繁殖，用乙醇或乙酸乙酯提取细胞粗提物，即得到抗紫外线细胞粗制剂。本发明是这样实现的一、高抗紫外线细胞克隆的获得本发明的培养基为在常规的MS培养基中添加物质后的培养基。
高抗紫外线细胞克隆经由原生质体的获得及紫外线重复筛选工序得到，具体步骤如下a.原生质体的获得挑取柴胡疏松的颗粒状愈伤组织，用镊子捏碎，转入添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、pH5.8--6.0的MS液体培养基中震荡培养7天，在无菌条件下，将已分散的悬浮细胞再转入相同配方的液体培养基上振荡培养7天，共3--5次，然后将悬浮细胞用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/L CaCl2、1％--3％纤维素酶RS和0.3％果胶酶Y-23、pH 5.8的等渗混合酶液去壁处理，并在50-200rpm/min震荡1-3小时，初步过滤后用300--500rpm/min离心2-10分钟，回收原生质体；b.紫外线重复筛选用0.4--0.8mol/L甘露醇、2-5mmol/L CaCl2、pH 5.8的等渗洗液清洗原生质体3-4次，将等渗洗液悬浮原生质体移入3个10cm直径的培养皿中，密度为103--107个/l，放置于超净工作台上，用38-48J/cm2紫外线照射100-130秒；照射完毕后，用添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白400--600mg/l、2，4-D0.5--2mg/L、蔗糖8-10％、对氧氮乙环乙烷吡咯磺酸800-1000mg/L、2，4-D 0.5--2mg/L、pH5.6--6.0的原生质体MS培养基置换洗液，然后盖上培养皿盖并用胶带封口，置于黑暗中，在25℃培养15-20天；随后取出形成了小细胞团的原生质体，在添加了谷氨酰胺100-150mg/l、水解酪蛋白50--200mg/l、2，4-D 0.5--2mg/L、蔗糖3％、0.7％的琼脂、pH5.8--6.0的MS固体培养基上培养7天，获得3个细胞克隆；将这3个细胞克隆繁殖至每个克隆有1g鲜重时，各取少量愈伤组织细胞重新去壁，再次用48J/cm2紫外线照射130秒，得到一个正常存活原生质体，随后再生细胞壁恢复分裂，得到来源于这一个原生质体的抗紫外线细胞克隆，命名为Anti-UV Clone。
二、抗紫外线制剂的制备抗紫外线制剂经乙醇或乙酸乙酯提取工序得到。具体如下(1)用乙醇提取抗紫外线制剂a.将高抗紫外线细胞克隆的活细胞用少量90％乙醇研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取4-8小时，再在50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得胶状粗提物；b.烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡1-2小时，然后研磨，其余步骤同鲜活细胞。
(2)用乙酸乙酯提取抗紫外线制剂a.将高抗紫外线细胞克隆的活细胞用少量90％乙醇研磨，再加入20倍体积的乙酸乙酯，在30℃温度下密闭提取4-8小时，再在50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得胶状粗提物；b.烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡1-2小时，然后研磨，其余步骤同鲜活细胞。
本发明具有制备方法简便、成本低、抗紫外线佳等优点。

实施例1抗紫外线制剂经乙醇或乙酸乙酯提取工序得到。具体如下(1)用乙醇提取抗紫外线制剂a.将高抗紫外线细胞克隆的活细胞用少量90％乙醇研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取4小时，再在50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得胶状粗提物；b.烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡1-2小时，然后研磨，其余步骤同鲜活细胞。
(2)用乙酸乙酯提取抗紫外线制剂a.将高抗紫外线细胞克隆的活细胞用少量90％乙醇研磨，再加入20倍体积的乙酸乙酯，在30℃温度下密闭提取4小时，再在50℃温度下用旋转蒸发仪去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得胶状粗提物；b.烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡1小时，然后研磨，其余步骤同鲜活细胞。
将上述方法得到的提物用纯水复溶，按1％涂抹豚鼠皮肤可以获得相当于SPF15-20的防晒效果。
实施例2基本同实施例1。不同之处为(1)用乙醇提取抗紫外线制剂中高抗紫外线细胞克隆的活细胞在50℃温度下密闭提取时间为6小时；烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡的时间为了1.5小时；(2)用乙酸乙酯提取抗紫外线制剂中高抗紫外线细胞克隆的活细胞在50℃温度下密闭提取时间为6小时；烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡的时间为了1.5小时。
将上述方法得到的提物用纯水复溶，按2％涂抹豚鼠皮肤可以获得相当于SPF15-30的防晒效果。
实施例3基本同实施例1。不同之处为(1)用乙醇提取抗紫外线制剂中高抗紫外线细胞克隆的活细胞在50℃温度下密闭提取时间为8小时；烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡的时间为了2小时；(2)用乙酸乙酯提取抗紫外线制剂中高抗紫外线细胞克隆的活细胞在50℃温度下密闭提取时间为8小时；烘干的高抗紫外线细胞克隆的细胞在50℃温度下，先用少量75％乙醇浸泡的时间为了2小时。
将上述方法得到的提物用纯水复溶，按3％涂抹豚鼠皮肤可以获得相当于SPF15-30的防晒效果。


本发明涉及一种用细胞工程技术获得的抗紫外线制剂，属于生物技术领域。该抗紫外线制剂经如下乙醇或乙酸乙酯提取工序得到。(1)用乙醇提取抗紫外线制剂时a.活细胞用90％乙醇研磨，再加入20倍体积的75％乙醇，在50℃温度下密闭提取4小时，然后去除乙醇及水，至最后20min回收溶剂体积不会变化时，即可获得胶状粗提物；b.烘干的细胞在50℃温度下用75％乙醇浸泡1－2小时，其余步骤同鲜活细胞。(2)用乙酸乙酯提取抗紫外线制剂时a.将活细胞用90％乙醇研磨，再加入20倍体积的乙酸乙酯，在30℃温度下密闭提取4小时，然后去除乙醇及水，即可获得胶状粗提物。b.烘干的细胞在50℃温度下用75％乙醇浸泡1小时，其余步骤同鲜活细胞。本发明具有成本低、抗紫外线佳等优点。