专利名称：低分化的甲状腺癌细胞系pdtc-1及其应用的制作方法甲状腺未分化癌是致死率较高的肿瘤，虽然占甲状腺恶性肿瘤的1% _5%，但甲状腺未分化癌死亡患者却占甲状腺癌死亡患者的一半以上，即使采用包括手术、放疗、化疗的综合治疗，中位生存期仅2.9-10月，I年生存率在9.7 % -37.8 %，3年生存率在11.7%-31.2%。低分化的甲状腺癌是甲状腺未分化癌的一种特殊类型，是分化好的甲状腺癌向未分化的甲状腺癌演化的一个阶段，因此对于研究甲状腺癌的生物学特点有重要的价值。由于甲状腺未分化 癌发病率低、死亡率高，进行大样本的随机对照研究较困难，文献报道多为回顾性总结，缺乏可信度较高的循证医学证据，因而建立动物的移植瘤模型便成为进行实验研究的理想方法。1962年英国人Grist首先发现裸小鼠(nude mice)，之后研究表明这是由于小鼠染色体等位基因突变而引起，表现为先天性胸腺发育不良，皮肤无毛，T淋巴细胞免疫缺陷。1969年Rygaard和Povlesev首先将人类结肠腺癌移植裸小鼠成功，为肿瘤的研究开创了新局面。目前尚无有关甲状腺低分化癌的细胞株及肿瘤模型报道。
本发明的一个目的是提供一种低分化的甲状腺癌细胞株及其培养方法和应用。本发明所提供的低分化的甲状腺癌细胞株，其保藏编号为CGMCC N0.4939。本发明的培养上述细胞株的方法，包括如下步骤:将上述细胞株接种于细胞培养基中，培养，得到增殖的权利要求1所述细胞株；所述细胞培养基的含10%胎牛血清的PRM 1640培养基。上述培养方法中，所述培养的温度为37°C，所述培养的二氧化碳体积浓度为5%。上述细胞株在构建用于开发具有抑制甲状腺癌功能的药物的模型中的应用也属于本发明的保护范围。上述细胞株在开发具有抑制甲状腺癌功能的药物中的应用也属于本发明的保护范围。上述细胞株在构建甲状腺癌移植瘤模型中的应用也属于本发明的保护范围。上述任一所述应用中，所述甲状腺癌为分化好的甲状腺癌、低分化的甲状腺癌和/或未分化的甲状腺癌。上述任一所述应用中，所述模型为鼠模型。本发明建立了甲状腺低分化癌的细胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，为研究甲状腺癌细胞学提供可筛选的细胞系，可用于构建筛选甲状腺癌敏感化疗药物的重要模型。在本发明的基础上，可以从基因水平、从蛋白质水平研究甲状腺分化好、低分化及未分化癌的差异，对于阐述甲状腺癌的发生机制、发现治疗靶点有重要意义。本发明为研究甲状腺癌的演化及低分化癌的生物学特性提供平台，利于对甲状腺癌的发生机制、转移复发进行深入研究。图1为裸鼠甲状腺癌移植瘤生长曲线。图2为裸鼠移植瘤(接种后第20天)。

将细胞株roTC-ι于2011年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.4939，分类命名为低分化甲状腺癌细胞系-1，细胞株名称为I3DTC-1。二、应用一建立甲状腺癌移植瘤模型裸鼠购自中国医学科学院实验动物研究所，实验动物编号SCXK(京)2009-0004，均为雌性BALB/c nu小鼠，5周龄，体重(18±2)g。裸鼠饲养在光照充足，常温，饮食不限的SPF级动物饲养室内。模型构建方法:取健康裸鼠，选取IO6细胞注射至裸鼠右腋下，饲养4 6周，得到的裸鼠即为甲状腺癌移植瘤模型。肿瘤检测:接种细胞株roTC-Ι后(接种当天记作第O天)，接种2-3周后即可见皮下硬结，在肿瘤长径达到0.5cm即可开始测量，隔天以游标卡尺测量肿瘤的长径、短径，按V=ab2/2计算肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线。待裸鼠体内肿瘤生长至直径达1.5cm时处死小鼠，在无菌条件下剥离肿瘤，生理盐水清洗数次，剔除坏死的组织，将剩余的肿瘤组织标本进行免疫组化检测，检测指标见表I。表I中的各个分子均是低分化的甲状腺癌的标志性物质。免疫组化检测中使用的一抗如下:免疫组化试剂均购自福州迈新公司，检测E-cadherin:E_钙粘附蛋白，鼠抗人单克隆抗体，MAB-0589 ；检测β -catenin: β -1丐联蛋白，鼠抗人单克隆抗体，ΜΑΒ-0259 ；
检测TG:甲状腺球蛋白，鼠抗人单克隆抗体，MAB-0161 ；检测P53:P53,鼠抗人单克隆抗体，MAB-0142 ；检测K1-67:K1-67,鼠抗人单克隆抗体，MAB-0129 ；检测VEGFR-2:KDR/FIK_1，兔抗人多克隆抗体，RAB-0522 ；检测PDGFR- β:兔抗人多克隆抗体，Labvision公司，RB-1692 ；检测VEGF:血管内皮生长因子，兔抗人多克隆抗体，RAB-0157 ；免疫组化检测中使用的二抗为福州迈新公司的即用型非生物素免疫组化检测试剂盒，产品编号Kit-9901，试剂盒包括增强剂和酶标羊抗鼠/兔聚合物两种试剂。重复上述模型构建和肿瘤检测的操作，重复20次，第一次操作得到的模型记作第I代模型，第二次操作得到的模型记作第2代模型，依次类推，第20次操作得到的模型记作第20代模型。每次观察的时间为30-50天。模型中肿瘤的表型如图2所示。第13代的肿瘤生长曲线如图1所示，其它代的肿瘤生长曲线与其无显著差异。由此得出的结论:该甲状腺低分化癌细胞系成瘤稳定，生物学特性完整，可作为以后研究甲状腺癌药物筛选的良好模型。每代的免疫组化检测结果如表I所示。表I中免疫组化结果判断根据福州迈新公司提供的参考标准，土表示较难判断，++++表示强阳性，+++表示中阳性，++表示阳性，+表示弱阳性，-表示阴性。

表I裸鼠传代过程中免疫组化指标变化


本发明公开了低分化的甲状腺癌细胞系PDTC-1及其应用。该细胞株为低分化的甲状腺癌细胞株，其保藏编号为CGMCC No.4939。本发明建立了甲状腺低分化癌的细胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，为研究甲状腺癌细胞学提供可筛选的细胞系，可用于构建筛选甲状腺癌敏感化疗药物的重要模型。在本发明的基础上，可以从基因水平、从蛋白质水平研究甲状腺分化好、低分化及未分化癌的差异，对于阐述甲状腺癌的发生机制、发现治疗靶点有重要意义。本发明为研究甲状腺癌的演化及低分化癌的生物学特性提供平台，利于对甲状腺癌的发生机制、转移复发进行深入研究。