甲状腺癌易感基因无创检测试剂盒的制作方法[0002]甲状腺癌即甲状腺组织的癌变。自20世纪80年代中期前苏联切尔诺贝利核电站泄漏事故以后，甲状腺癌是近20多年发病率增长最快的尸体恶性肿瘤，年均增长6.2%。目前，甲状腺癌已是女性恶性肿瘤第5位的常见肿瘤。[0003]由于甲状腺未分化癌恶性程度高，病情发展迅速，以侵犯周围的器官组织如气管、食管、颈部的神经和血管，因此，往往就诊时已是晚期，无法手术切除。因此如果能够提前预测评估出人体的甲状腺癌发病风险，做好早期预防和治疗会大大降低甲状腺癌的发病几率。通过研究表明，XRCCl基因上Arg399Gln位点以及hMSH2基因上IVS12_6T>C位点与甲状腺癌的发病密切相关。[0004]DNA错配修复系统是细胞复制后的一种修复机制，发挥着维持DNA复制的高保真度和基因组稳定性、降低自发突变的功能。hMSH2是错配修复系统的一种关键基因，其变异引起的错配修复功能变化在多种肿瘤的发生过程中具有普遍的作用。hMSH2基因的第13外显子上游第12内含子内第6位核苷酸的替换突变(IVS12-6T>C)位于内含子与外显子的交界处，临近剪切接受部位，该位点的突变很可能影响mRNA前提加工过程中mRNA的剪接，从而改变hMSH2蛋白质的功能。[0005]XRCCl是人类X射线交错互补修复基因1.XRCCl基因编码的蛋白对因电离辐射和烷基化物引起的DNA单链断裂具有重要的修复作用。该蛋白与DNA连接酶II1、聚合酶β、多聚ADP核糖转移酶交互作用，参与DNA的碱基切除修复通路。研究表明，该基因上第399号氨基酸Arg被Gln替代，使得碱基切除修复能力被削弱，从而影响个体的肿瘤易感性。[0006]综上所述，鉴于hMSH2基因、XRCCl基因在甲状腺癌变过程中有着不可忽视的作用，可以将上述基因作为遗传易感因素来检测出受检者在甲状腺癌发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患甲状腺癌的高危人群，从而有针对性的预防和治疗甲状腺癌，这对于降低甲状腺癌的发病率有非常重要的意义。
[0007]基于本发明提供了一种检测甲状腺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XRCCl基因上Arg399Gln位点以及hMSH 2基因上IVS12_6T>C的2个单核苷酸多态性位点基因型可作为评估甲状腺癌发病的危险因子的基础上，本发明提供一种甲状腺癌易感基因检测试剂盒。
[0008]该试剂盒包括:
检测本发明提供了一种检测甲状腺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XRCCl基因上Arg399Gln位点以及hMSH2基因上IVS12_6T>C的2个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0010]本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。

[0011]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0012]除非另行定义，文 中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0013]实施例1.检测试剂盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0014]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(I)hMSH2 (IVS12-6T>C)正向引物:5’ TGTGGGCAGGCTGTGGTT3’
hMSH2 (IVS12-6T>C)反向引物:5’ CTCCCATATTGGGGCCTGCA3’
(2)XRCCl (Arg399Gln)正向引物:5’ TGACCTTGCGGGACCTTAG3’
XRCCl (Arg399Gln)反向引物:5’ CCAAGACCCTTTCACTCCTATC3
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ml ;25mM的dNTP混合液0.2ml、5U/ul Taq 酶 0.125ml、DNA 模板 Iml (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ml、ddH2019.175ml ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0015]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0016]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。[0017]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)hMSH2 (IVS12-6T>C)测序引物:5’TGTGGGCAGGCTGTGGTT3’
(2)XRCCl (Arg399Gln)测序引物:5’ TGACCTTGCGGGACCTTAG 3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0018]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0019]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测序仪中。
[0020]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0021]实施例2.对人们进行预防甲状腺癌发病的基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0022]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的本发明提供了一种检测甲状腺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XRCCl基因上Arg399Gln位点以及hMSH2基因上IVS12-6T>C的2个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这2个SNPs位点的基因型。
[0023]3.甲状腺癌发病高危人群风险评估
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具甲状腺癌易感基因风险评估分析报告单。报告中详细说明了本发明提供了一种检测甲状腺癌易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测XRCCl基因上Arg399Gln位点以及hMSH2基因上IVS12_6T>C的2个基因上SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医师向受检者详细说明和解读甲状腺癌易感基因无创检测报告单。