专利名称：一种海洋贝毒素单抗制备方法近年来，全球气候变暖、赤潮频发，海洋贝毒素引发的海产品安全问题日益严重， 已成为公共卫生和进出口检验检疫中值得关注的重大问题。导致食源性中毒的海洋贝毒素 多来源于某些藻类，通过食物链蓄积于贝、螺等海产品中，毒性放大，多数毒素性质非常稳 定，一般加工处理不能破坏，由误食有毒海产品而引发中毒的事件时有发生，毒素对机体具 有致癌、致畸、致突变等毒性作用，且中毒后无特效药救治。因此开展海洋贝毒素的快速检 测方法，确保海产品食用安全具有重要的公共卫生意义。目前最常用、最成熟的方法是高效 液相或液质联用技术。但此项技术所需仪器设备价格昂贵，样品前处理过程困难，需要专业 的人员操作，不适于现场携带使用等缺点。人们正在积极探索研究海洋贝毒素的免疫学方 法，此法常以单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)为探针，采用竞争方式，被公认为是 一种快速、灵敏、经济、实用的检测方法，已有多种海洋毒素全安检测试剂盒商品化。免疫学 方法的建立最关键的步骤就是抗体的获得。而单克隆抗体由于理化性状高度均一，与抗原 结合的特异性强、容易大量获得，因此在免疫学检测中备受青眯。对于海洋贝毒素类食品污 染物来说，其分子量小，结构简单，不能刺激机体产生抗体，因此若想制备其单抗，必须将其 与大的载体蛋白偶联，使其成为载体蛋白上的一个抗原表位，借助载体效应激活T淋巴细 胞，进而使B细胞活化并分泌针对小分子的抗体。在常规单抗制备过程中，要采用免疫原进 行免疫，检测原(与免疫原载体不同)进行检测，需制备两种偶联物，麻烦又浪费；免疫脾细 胞与SP20细胞融合后要进行大量的筛选工作，多数融合的杂交瘤分泌的抗体均是针对载 体蛋白，针对小分子抗体的杂交瘤数量很少，常规利用检测原进行筛选会消耗大量标准物 质；另外由于海洋生物毒素制备困难，价格昂贵，据调查腹泻性贝毒大田软海绵酸Img最高 时达两万多元人民币，石房蛤毒素竞高达十几万元。要想获得这类物质的一株单抗顺利的 话至少也需数十万元，而标准品的消耗主要体现在杂交瘤细胞的筛选上，很多研究均因为 标准抗原用量大引起的资金问题限制了其免疫学方法的建立。
本发明的目的在于提供一种海洋贝毒素单抗制备方法，解决昂贵小分子海洋贝毒 素在单克隆抗体制备过程中杂交瘤的筛选消耗大量标准抗原问题，其改进了常规小分子单 抗制备过程中两种抗原的使用与抗体杂交瘤细胞的筛选方法，免疫抗原与检测抗原只需一 种偶联物，不但能够节省大量的抗原标准物，而且获得的抗体与抗原的结合活性好，用改进 后的方法制备的海洋贝毒素大田软海绵酸的单抗，具体采用活泼酯法合成大田软海绵酸与 载体蛋白的偶联物作为免疫原兼检测原，免疫BALB/c小鼠，常规细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，利用改进的方法对融合细胞所分泌的抗体进行筛选； 经过3次克隆，获得1株可稳定分泌抗OA的杂交瘤细胞株，该株杂交瘤细胞分泌的抗体属 于IgGl亚类，相对分子质量约为160kD，抗体滴度为2. 56 X 106，抗体亲和力为9. OX IO8L/ mol，与软骨藻酸、膝钩藻毒素1/4、膝钩藻毒素2/3、石房蛤毒素、微囊藻毒素、节球藻毒素、 河豚毒素等非腹泻性贝毒没有交叉反应，不但节约大量的标准抗原，而且获得的抗体能够 用于ELISA等免疫学方法的建立。本发明的技术方案是这样实现的一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤筛选的抗原为同一偶联物，并采用了正筛法 和负筛法相结合的筛选法进行小分子贝毒素单抗杂交瘤细胞的筛选，其步骤如下(1)、抗原的制备采用活泼酯法制备免疫原兼检测原，操作方法如下lmg贝毒素大田软海绵酸OA、 0. 155mg N-羟丁二酰亚胺、0. 285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于100 μ LN，N 二甲基甲酰胺N， N-DMF中混均，室温孵育2h，以载体蛋白与小分子物质摩尔比为1 20 1 50的比例加 入载体蛋白，并试先用50 μ L 0. lmol/L NaHCO3溶解，室温继续孵育2h，未反应的物质通过 超滤离心去除，将偶联抗原用一定体积的PBS缓冲液(pH 7.4)溶起，_20°C保存备用；(2)、动物免疫与效价测定采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠，首次免疫用100 μ g偶联抗原 与等量福氏完全佐剂混勻分3次腹腔注射，间隔2d ；3周后再用100 μ g偶联抗原与等量福 氏不完全佐剂混勻，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量偶联抗原重复腹腔加强免疫；用载 体竞争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下偶联抗原用0. 05mol/L pH9. 6的 碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL，每孔100 μ L包被96孔酶标板，4°C过夜；用PBST洗板3次， 每次3min ；加入载体蛋白(1 μ g/mL)与等量系列稀释的血清共100 μ L，37°C反应40min ； 洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔100μ L，37°C，30min，洗板3次；加邻苯 二胺(OPD)显色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定 490nm处吸光度值，用阴性血清作对照；(3)、细胞融合与筛选效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术 将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细 胞进行筛选①负筛选择去除针对载体克隆对融合细胞先用载体进行筛选载体抗原用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL, 4°C过夜包被96孔酶标板，用PBST洗板 3次，每次3min ；加入细胞培养上清液100 μ L，37°C板反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除 大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；②正筛选择针对OA的目标克隆用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂交 瘤细胞用偶联抗原包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100yL，37°C板内反应 40min ；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3次； 加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值；用阴性和阳性血清作对照，选择阳性克隆进入下一轮筛选；③竞争优选杂交瘤细胞经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法筛 选具有抗原竞争活性的抗体用偶联抗原(lyg/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品 (20ng/mL)与细胞培养上清各50 μ L，37°C板内竞争反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值 最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤 细胞；所述的海洋贝毒素是腹泻性贝毒素大田软海绵酸，所述的免疫原兼检测原为大田软海绵酸与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)或人免疫球蛋白(hlgG)等经 活泼酯法制备的偶联物；其大田软海绵酸单克隆抗体属于IgGl亚类，相对分子质量约为 160kD，抗体滴度为2. 56 X 106，抗体亲和力为9. 0 X 108L/mol。所述的在单抗杂交瘤细胞筛选过程中采用了正筛负筛相结合的筛选法，即先用载 体蛋白对融合杂交瘤细胞进行筛选，去除大量针对载体蛋白呈阳性的杂交瘤细胞株；阴性 克隆继续用免疫原兼检测原与标准品竞争筛选针对目标毒素的杂交瘤。本发明的积极效果是减少了常规方法中免疫原与检测原采用不同制备的麻烦与 浪费，尤其是在杂交瘤筛选过程中利用载体负筛法选择去除大量阴性克隆，利用正筛及抗 原竞争筛选法选择优异阳性克隆，筛选的杂交瘤细胞分泌的抗体具有较好的抗原竞争能 力，减少了大量标准抗原的消耗，具有制备简单方便、抗原用量小，节约成本，抗体竞争活性 好等优点。度值，用阴性血清作对照。3.细胞融合与筛选效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细 胞进行筛选(1)负筛选择去除针对载体克隆对融合细胞先用载体进行筛选载体抗原BSA用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL，4°C过夜包被96孔酶标板，用PBST洗 板3次，每次3min ；加入细胞培养上清液100 μ L，37。C反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除 大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；(2)正筛选择针对OA的目标克隆用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤 细胞用OA-BSAd μ g/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μ L，37°C板内 反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3 次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔1001^，371，10-151^11;加入501^终止液，酶联免疫 检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；(3)竞争优选杂交瘤细胞经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法 筛选具有抗原竞争活性的抗体用OA-BSAd μ g/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品 (20ng/mL)与细胞培养上清各50 μ L，37°C板内竞争反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值 最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤 细胞；4.腹水制备与抗体特性研究将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0. 5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10 14d后收集腹水，间接 ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸一硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析， 利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒 鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。实施例2 1. OA-OVA抗原的制备大田软海绵酸0kadaicAcid，OA卵清蛋白0valbumin，OVA采用活泼酯法制备免疫原兼检测原0A-0VA，操作方法如下lmg大田软海绵酸0A、 0. 155mg N-羟丁二酰亚胺、0. 285mg N, N双环乙烷碳二亚胺于IOOyL N, N 二甲基甲酰胺 (N，N-DMF)中混均，室温孵育2h，加入2. 5mg OVA (溶于50 μ L 0. lmol/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用250 μ L的PBS缓冲液(ρΗ 7.4)溶 起，使其蛋白浓度为10mg/mL，_20°C保存备用。2.动物免疫与效价测定采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100μ gOA-OVA与 等量福氏完全佐剂混勻分3次腹腔注射，间隔2d ；3周后再用100 μ gOA-OVA与等量福氏不 完全佐剂混勻，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量0A-0VA重复腹腔加强免疫；用OVA竞争 ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下0A_0VA用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲 液稀释至1 μ g/mL,每孔100 μ L包被96孔酶标板，4°C过夜；用PBST洗板3次，每次3min ； 加入OVA (1 μ g/mL)与等量系列稀释的血清共100 μ L，37°C反应40min ；洗板3次；加入酶标 羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液， 每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值， 用阴性血清作对照。3.细胞融合与筛选效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术 将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细 胞进行筛选(1)负筛选择去除针对载体克隆对融合细胞先用载体进行筛选载体抗原OVA用 0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至1 μ g/mL，4°C过夜包被96孔酶标板，用PBST洗 板3次，每次3min ；加入细胞培养上清液100 μ L，37。C反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去除 大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；(2)正筛选择针对OA的目标克隆用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤 细胞用OA-OVAd μ g/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100μ L，37°C板内 反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min，洗板3 次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔1001^，371，10-151^11;加入501^终止液，酶联免疫 检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一轮筛选；(3)竞争优选杂交瘤细胞经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法 筛选具有抗原竞争活性的抗体用OA-OVAd μ g/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标准品 (20ng/mL)与细胞培养上清各50 μ L，37°C板内竞争反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗 小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔 100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，OD值 最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂交瘤 细胞；4.腹水制备与抗体特性研究将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0. 5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10 14d后收集腹水，间接 ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸一硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析， 利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。实施例3 1. OA-hlgG抗原的制备大田软海绵酸0kadaicAcid，OAA^iiSitSS human immunoglobulin G, hlgG采用活泼酯法制备免疫原兼检测原OA-hlgG，操作方法如下lmg大田软海绵酸 0A、0. 155mg N-羟丁二酰亚胺、0. 285mg N，N双环乙烷碳二亚胺于IOOyL N，N 二甲基甲酰 胺(N，N-DMF)中混均，室温孵育2h，加入4. Omg hlgG(溶于50yL 0. lmol/L NaHCO3)，室温继 续孵育2h，未反应的物质通过超滤离心去除，将偶联抗原用400yL的PBS缓冲液(pH 7.4) 溶起，使其蛋白浓度为10mg/mL，-20°C保存备用。2.动物免疫与效价测定采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c雌性小鼠。首次免疫用100yg0A-hIgG与 等量福氏完全佐剂混勻分3次腹腔注射，间隔2d ；3周后再用100 μ gOA-hlgG与等量福氏不 完全佐剂混勻，腹腔分3次免疫。此后每2周用半量OA-hlgG重复腹腔加强免疫；用hlgG竞 争ELISA法测定血清效价，其具体ELISA程序如下0A_hIgG用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐 缓冲液稀释至0. 5 μ g/mL，每孔100 μ L包被96孔酶标板，4°C过夜；用PBST洗板3次，每次 3min ；加入hlgG (0. 5 μ g/mL)与等量系列稀释的血清共100 μ L，37°C反应40min ；洗板3次； 加入酶标羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD) 显色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸 光度值，用阴性血清作对照。3.细胞融合与筛选效价达到4000倍以上，尾静脉加强免疫1次，3d后取脾脏，采用PEG细胞融合技术 将免疫脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0融合，采取如下改进正筛负筛结合法对杂交瘤细 胞进行筛选(1)负筛选择去除针对载体克隆对融合细胞先用载体进行筛选载体抗原hlgG 用0. 05mol/L pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释至0. 5 μ g/mL, 4°C过夜包被96孔酶标板，用PBST 洗板3次，每次3min ；加入细胞培养上清液100 μ L，37。C反应40min ；洗板3次；加入酶标羊 抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每 孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，去 除大量针对载体的阳性孔，阴性克隆进入下一轮筛选；(2)正筛选择针对OA的目标克隆用贝毒素偶联抗原筛选针对小分子抗体的杂瘤细胞用OA-hlgG (0. 5 μ g/mL)包被ELISA板过夜，洗涤后加入细胞培养上清100 μ L，37°C 板内反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG (1 4000)，每孔100 μ L，37°C，30min， 洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液，每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶 联免疫检测仪测定490nm处吸光度值，用阴性和阳性血清作对照；选择阳性克隆进入下一 轮筛选；(3)竞争优选杂交瘤细胞经上述筛选得到的贝毒素阳性克隆再次用抗原竞争法 筛选具有抗原竞争活性的抗体用OA-hlgG (0. 5 μ g/mL)包被ELISA板，洗涤后加入OA标 准品(20ng/mL)与细胞培养上清各50 μ L，37°C板内竞争反应40min ；洗板3次；加入酶标羊抗小鼠IgG(l 4000)，每孔10(^1^，371，301^11，洗板3次；加邻苯二胺(OPD)显色液， 每孔100 μ L，37°C，10-15min ；加入50 μ L终止液，酶联免疫检测仪测定490nm处吸光度值， OD值最小者为最具竞争活性的抗体，此细胞株继续克隆直至全部为阳性，即为优选出的杂 交瘤细胞；4.腹水制备与抗体特性研究将高压灭菌的石蜡油注射到10周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔0.5 1. OmL/只，1 周后再注入2X IO6个杂交瘤细胞。根据小鼠的腹部膨大情况，10 14d后收集腹水，间接 ELISA方法测定腹水单抗效价，采用辛酸一硫酸铵法对腹水进行纯化，SDS-PAGE电泳分析， 利用在凝胶中的相对迁移率与相对分子质量回归方程计算分子量；用单抗亚类鉴定试剂盒 鉴定单抗亚类。根据文献计算亲和常数；用竞争ELISA法对相关类似毒素作交叉反应测定。本发明涉及一种海洋贝毒素单抗制备方法，其特征在于制备小分子贝毒素单抗用于动物免疫和杂交瘤细胞筛选的抗原为同一偶联物，减少了常规小分子物质单抗制备方法中免疫原与检测原不同制备的麻烦与浪费；并采用了正筛法和负筛法相结合的筛选法进行单抗杂交瘤细胞的筛选，可减少大量标准抗原的消耗，其筛选的杂交瘤细胞分泌的抗体具有较好的抗原竞争活性。本发明积极效果是抗原制备简单、标准抗原用量小，节约成本，抗体竞争活性好。