用于肝移植中的耐受性的诊断和/或预后的方法和试剂盒制作方法

阿尔韦托·桑切斯富埃约, 胡安·何塞·洛萨诺萨尔瓦特利亚, 马克·马丁内斯略尔德利亚, 安东尼·里莫拉卡斯特利亚, 费利克斯·博内

2013年6月12日

2011年3月2日

2010年8月9日

巴塞罗纳医院诊所, 肝炎及消化疾病生物医药研究中心

C12Q1/68GK103154267SQ201180039283

肝移植 耐受性 诊断 用于

1.用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法，所述方法包括 a.从研究中的患者获得生物样品； b.评估在步骤a)中获得的样品中的全身和/或肝内铁储备的水平； c.通过将步骤b)的全身和/或肝内铁储备的水平与取自参比样品的全身或肝内铁储备的水平相比较，或与预定的阈值相比较，评估研究中的肝移植患者的耐受性或不耐受性状态2.根据权利要求1的方法，其中与不耐受的肝移植受者相比，在耐受的肝移植受者中，全身和/或肝内铁储备的水平显著更高3.根据权利要求1的方法，其中接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后包括 a.从研究中的患者的肝同种异体移植物获得生物样品； b.测量在步骤a)中获得的样品中的以下基因或其组合中的至少一种的表达水平TFRC, CDHR2、HMOXU MIF, HAMP, IFNG、PEBP1、SLC5A12、AD0RA3 和 DAB2 ； c.通过将所述步骤b)的所述基因或其组合中的至少一种的表达水平与取自参比样品的相同的基因或其组合的表达水平比较，评估研究中的所述患者对肝移植的耐受性或不耐受性4.根据权利要求3的方法，其中所述参比样品是选自以下中的RNA样品获得自健康的非移植肝组织的RNA库；市售的参比RNA ;或存在于包含之前经量化的数目的RNA分子的样品中的绝对参比RNA5.根据权利要求3的方法，其特征在于与取自所述参比RNA样品的相同基因的表达水平相比较，在耐受的肝移植受者中，基因TFRC和MIF是下调的，而基因raHR2、HM0Xl、HAMP、IFNG、PEBP1、SLC5A12、AD0RA3 和 DAB2 是上调的6.根据权利要求3的方法，其特征在于其还包括测量以下基因中的至少一种的表达水平LC5A12、VNN3、SOCSl、TTC3、RBM23、SH2D1B、NCRU TFRC, TUBA4A、TAF15、TIPARP, MOXl、MCOLNl、EBP 1、DHR2 和 AB27.根据权利要求6的方法，其特征在于其包括测量以下基因组合中的至少一种的表达水平LC5A12、VNN3、TFRC, SOCSU MIF, TTC3、RBM23、PEBPl、SH2DIB、NCR1、DAB2 和 AD0RA3 ；TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、HAMP、TUBA4A、TTC3、HMOX1、VNN3、NCR1、AD0RA3、TAF15、IFNG、SOCSI和 TIPARP ;M0X1、CDHR2、MIF、PEBP1、TFRC、SLC5A12、S0CS1、HAMP、VNN3 和 IFNG ;TFRC、PEBP1、MIF、CDHR2、SLC5A12、HAMP, SOCSl、IFNG 和 HMOXl ;TFRC、IFNG、CDHR2、AD0RA3、HAMP, MIF、PEBPl、VNN3、SOCSl、HMOXl 和 DAB2 ;TFRC、DAB2、MIF、PEBPl、IFNG、HAMP, SLC5A12、SOCSl、VNN3、AD0RA3、CDHR2、MCOLNl 和 HMOXl ;TFRC、、IFNG、HMOXU MCOLNU MIF、HAMP, AD0RA3、CDHR2、PEBPI 和 SOCSI ; EBP 1、TFRC、HMOX1、IFNG、MCOLN1、SOCS1、MIF、CDHR2、HAMP 和 AD0RA3 ;TFRC, PEBPl、IFNG、CDHR2、AD0RA3、VNN3、HMMOXl、DAB2、SOCSl、MIF 和 HAMP ;DHR2、AD0RA3、IFNG、TFRC、VNN3、HMOX1、PEBP1、M IF、SLC5A12、HAMP、SOCSI 和 MCOLNI ; LC5A12、TFRC、IFNG、MIF、DAB2、HMOX1、CDHR2、SOCS1、HAMP、PEBP1、VNN3、AD0RA3 和 MCOLNI；TFRC、SOCS1、HMOX1、PEBPl、VNN3、CDHR2、HAMP, IFNG、DAB2、MCOLNl、AD0RA3 和 MIF ;TFRC、PEBPl、VNN3、SOCSl、MIF、HMOXl、DAB2、HAMP, IFNG、CDHR2、AD0RA3 和 MCOLNl ;LC5A12、MIF、CDHR2、TFRC, IFNG、AD0RA3、HAMP, VNN3、SOCSl、MCOLNl、PEBPl 和 HMOXl ;TFRC、IFNG、CDHR2、AD0RA3、PEBPl、VNN3、MIF、HM0X1、MC0LN1、S0CS1、SLC5A12、DAB2 和 HAMP ;TFRC、VNN3、HAMP、CDHR2、SLC5A12、HMOXl、SOCSl、PEBPl 和 MIF ;AB2、TFRC, MIF、CDHR2、PEBPl、VNN3、TTC3、HMOXl 和 SOCSl ；TFRC、PEBPl、MIF、CDHR2、VNN3、IFNG、MCOLNl 和 SOCSl ;TFRC、PEBPl、MIF、SOCSl 和 CDHR2 ；AD0RA3、CDHR2、MIF、PEBPl、TAF15 和 TFRC ;CDHR2、MIF、PEBPl、SLC5A12、SOCSl、TAF15 和TFRC;AD0RA3、CDHR2、HAMP、MIF、PEBPl、SOCSl、TAF15 和 TTRC;CDHR2、HAMP、IFNG、MCOLNl、MIF、PEBPl、SOCSl、TFRC 和 VNN38.根据权利要求3的方法，其中测量由TFRC、IFNG和CDHR2组成的基因组合的表达水平9.根据权利要求1的方法，其中接受肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后包括 a.从研究中的所述患者的肝同种异体移植物获得生物样品； b.测量在步骤a)中获得的样品中的肝内铁储备的水平； c.通过将所述步骤b)的肝内铁储备的水平与取自参比样品的肝内铁储备的水平相比较，评估研究中的所述患者对肝移植的耐受性或不耐受性10.根据权利要求9的方法，其中与不耐受的肝移植受者相比，在耐受的肝移植受者中，肝内铁储备的水平显著更高11.根据权利要求1的方法，其中接受肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后包括 a.从研究中的所述患者的血清获得生物样品； b.测量在步骤a)中获得的样品中的蛋白铁蛋白的水平； c.通过将所述步骤b)的铁蛋白的水平与取自参比样品的相同蛋白的水平相比较，评估研究中的所述患者对肝移植的耐受性或不耐受性12.根据权利要求11的方法，其中与在不耐受的肝受者中相比，在耐受的肝受者中，铁蛋白的血清水平显著更高13.根据权利要求1的方法，其中接受肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后包括 a.从研究中的所述患者的肝同种异体移植物获得生物样品； b.测量在步骤a)中获得的样品中的磷酸化_Stat3的蛋白水平； c.通过将所述步骤b)的磷酸化_Stat3的蛋白水平与取自参比样品的相同蛋白的蛋白水平相比较，评估研究中的所述患者对肝移植的耐受性或不耐受性14.根据权利要求13的方法，其中与在不耐受的肝受者中相比，在耐受的肝受者中，磷酸化-Stat3的血清水平 显著更高15.根据权利要求1的方法，其中接受肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后包括 a.从研究中的所述患者的血清获得生物样品； b.测量在步骤a)中获得的样品中的铁调素的蛋白水平； c.通过将所述步骤b)的铁调素的蛋白水平与取自参比样品的相同蛋白的蛋白水平相比较，评估研究中的患者对肝移植的耐受性或不耐受性16.根据权利要求15的方法，其中与在不耐受的肝受者中相比，在耐受的肝受者中，铁调素的血清水平显著更高17.根据权利要求1至16中任一项的方法，所述方法还包括确定至少一个附加参数，所述至少一个附加参数对于接受肝移植的患者的耐受状态的诊断和/或预后是有用的18.根据权 利要求17的方法，其中所述附加参数是年龄和/或移植后的时间

本发明涉及人类医学领域更具体地，本发明侧重于用于接受肝移植的患者的耐受状态的体外诊断和/或预后的方法和试剂盒，所述方法和试剂盒包括评估在获得自研究中的患者的生物样品中的全身和/或肝内铁储备的水平，以及将其与参比样品的铁储备的水平比较，或与预定的阈值比较现有技术移植的移植物的长期存活主要依赖终生服用免疫抑制药物以防止移植物排斥这些药物在防止移植物排斥上是非常有效的，但是它们也与严重的副作用相关，所述副作用如肾毒性，机会性感染和肿瘤的风险增加，以及代谢并发症如糖尿病、高脂血症和动脉性高血压由于免疫抑制药物的副作用，耐受性的诱导是移植免疫学研究的主要目标之一，耐受性被定义为移植物在没有长期免疫抑制的情况下保持正常功能的状态在啮齿类动物中的大量移植物实验模型中有可能获得耐受性诱导然而，将这些实验性治疗应用于临床中却在很大程度上失败了在人中临床应用耐受性诱导的实验性治疗不成功的一个原因涉及缺少用于无创性诊断人移植物受者中的耐受性的精确工具最近的出版物指出迫切需要这种工具(N.Najafian等2006和Newell等2006)另一方面，尽管完全中止所有免疫抑制药物但是仍然保持正常的同种异体移植物功能在临床器官移植中偶有报道，尤其是在肝移植后自发接受移植物的患者通常被认为是“可操作地(operationally)”耐受的，并且提供了以下观点的证据在人类中实际上可以获得免疫耐受性肝移植是仅有的耐受性在大比例的患者中自发发生的临床情况实际上，完全停止免疫抑制可以在约21%的患者中实现(Lerut, J.等2006)不幸地，目前没有方法在尝试停止免疫抑制前鉴定这些患者因此，免疫抑制药物的完全中止在肝移植中很少尝试，并且因此许多患者继续被不必要地免疫抑制，并且这牵扯健康和经济问题之前主要在肾和肝受者中进行的鉴定移植中的耐受性的尝试已经采用抗原特异性功能性测定或抗原非特异性测 试在功能性测定中，在体外或体内利用供体抗原攻击受者 T 淋巴细胞(J.Cai 等 2004)，(J.Cai 等 2004)和(E.Jankowska-Gan E 等 2002)，(P.Sagoo等2010)从机械论的观点，这些测定是非常有价值的，因为它们是仅有的能够揭示哪些途径负责耐受性状态的特异性的测试不幸地，这些测定也难以进行，在实验室之间高度可变(难以标准化)，并且要求小心地冷冻保存的供体细胞的可用性出于这些原因，功能性测定对于广泛的临床应用不是最佳的，并且目前仅在有选择的、高度专业化的实验室中采用，并且基本用于研究目的抗原非特异性免疫监测试验构成目的在于受者免疫系统的表型表征，而不使用供体抗原攻击的多种方法在这些测试中，对T细胞受体⑶R3长度分布型式(TcLandscape)的研究，通过使用流式细胞术对外周血细胞进行免疫表型分型，和基因表达模式已经被用于鉴定对人的耐受性具有特征性的生物标志物TcLandscape技术已经被用于外周血中以区分耐受的肾受者和经历长期排斥的受者(S.Brouard等2005)然而，该技术是昂贵的，目前仅在一个实验室(Inserm643and TcLand Expression in Nantes, France)中可用，并且从未在肝移植中得到验证外周血免疫表型分型的使用已经利用来自耐受的肝肾移植受者的外周血样品进行发明人已知专注于该方法学的至少四个研究在来自美国的匹兹堡大学(G.V.Mazariegos等2003)的第一个研究中，据说pDC和mDC树突细胞亚群之间的比率可以区分儿科肝移植中的耐受的受者和不耐受的受者在来自京都市的第二个研究(Y.Li等2004)中，据说外周血中的δ-l和δ-2γ δ T细胞之间提高的比率在耐受的受者中比在不耐受的肝受者中更普遍在由本发明人协同的第三个研究(Martinez-Llordella等2007)中，与不耐受的受者相比，在耐受的肝受者的外周血中，观察到增加的CD4+CD25+T细胞的数目以及增加的S-1与δ-2ΥδΤ细胞的比率然而，在来自相同课题组的后续研究(Puig-Pey等Transplant Int2010)中，δ-1与δ-2 γ δ的比值被质疑此夕卜，这些测试中没有一个能够提供广泛的临床应用所需的精确性使用基因表达谱技术以鉴定耐受性的生物标志物已被用于肾移植和肝移植两者中(S.Brouard等PNAS2007 ；Μ.Martinez-Llordella等J Clin Invest2008 ;Κ.Newell等.J Clin Invest2010 ；P.Sagoo等,J Clin Invest2010)这些技术比上述测试更容易标准化此外，参考的研究显示已鉴定的转录生物标志物的使用是一种用于区分摆脱免疫抑制药物的耐受的受者与需要保持免疫抑制的不耐受的受者的非常精确的方式目前文献中发表的研究的主要限制是它们未尝试前瞻性地验证它们的结果换言之，它们不能证明是否这些生物标志物可以在中止免疫抑制前鉴定耐受的受者在没有该证明的情况下，不可能确定在基因表达中观察到的差异不是实际上由不耐受的受者的组中的药理学免疫抑制的作用所导致的此外，之前报道的研究中没有一个尝试研究基因表达中的差异在移植物自身的水平上是否也存在虽然长期使用免疫抑制药物是目前确保移植的同种异体移植物的长期存活的唯一方式，但是这些药物昂贵且与导致极大的发病率和死亡率的严重副作用(肾毒性、肿瘤和感染发生、糖尿病、心血管并发症等)有关因此，任何能够在移植中显著减少免疫抑制药物的使用的策略对移植受者的健康和生活质量都可以具有大的影响总之，提供经验证能够预测肝移植患者的耐受性，并且因此能够指示免疫抑制药物对所述患者的施用可以省去的方法仍然是有挑战性的