器官保护溶液制作方法

F·J·范德伍德, B·雅德, D·赫尔, V·劳克斯, C·P·劳伦兹

2002年3月13日

2000年1月14日

1999年1月20日

诺尔股份公司

A61P37/00GK1339944SQ00803768

溶液 器官 保护

1.含有一定量下列成分的用于有效维持细胞完整性和细胞存活力的器官保护溶液a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；b)5-100g/l羟乙基淀粉2.根据权利要求1所述的器官保护溶液，它含有a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；b)5-100g/l羟乙基淀粉；c)5-100mmol棉子糖3.根据权利要求1和2所述的器官保护溶液，它含有a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为具有至少12.5重量％的聚硫酸化糖胺聚糖类；b)5-100g/l羟乙基淀粉；c)5-100mmol棉子糖；d)5-40mmol KH2PO4；e)1-50mmol MgSO4；f)1-50mmol腺苷；g)0.5-5mmol别嘌呤醇；h)1-10mmol谷胱甘肽4.权利要求1-3所述的器官保护溶液在制备用于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型和MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂中的用途5.权利要求4所述的器官保护溶液在治疗和预防与γ干扰素诱导的增量调节 MHC I型和MHC II型蛋白质和ICAM 1相关的疾病中的用途6.权利要求4或权利要求5所述的器官保护溶液在治疗移植患者中的用途7.权利要求4或权利要求5所述的器官保护溶液在保护和贮存计划用于移植的器官中的用途

本发明涉及具有至少12.5％的硫含量的聚硫酸化糖胺聚糖类在制备用于抑制干扰素γ诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM1的药物制剂中的用途本发明进一步涉及含有聚硫酸化糖胺聚糖类的器官保护溶液和保护体内移植器官的方法糖胺聚糖类且特别是肝素和类肝素在制备用于治疗循环障碍的药物制剂中的用途是众所周知的最近以来，已经描述了用于一系列其它疾病的糖胺聚糖类的用途因此，US5,236,910中要求保护糖胺聚糖类在治疗糖尿病性肾病和神经病中的用途van der Pijl等已经描述了低分子量肝素在相同适应症中的用途(J Americ Soc Nephrol，1997，8456-462)US5,032,679中要求保护糖胺聚糖类在抑制平滑肌细胞增殖和相关疾病中的用途在US4,966,894中要求保护聚硫酸化肝素在治疗由逆转录病毒导致的疾病Gralinski等已经描述了用聚硫酸化肝素调制补体系统在Clin Exp Immunol(1997，107578-584)中，Douglas等已经研究了用肝素、硫酸乙酰肝素或肝素样分子拮抗γ干扰素的炎症促进作用肝素能够影响γ干扰素的免疫原性作用当移植器官时，不需要的排斥反应时常发生为了预防这类排斥反应，已经采用了大量不同的途径因此且最重要的是，已经比较了供体和受体的组织相容性抗原仅将供体和受体最大程度相同或具有极为相似组织相容性抗原的那些器官进行移植尽管如此，但是不合需要的器官排斥仍然持续发生例如，发生急性肾异源移植排斥，其中由T淋巴细胞识别异源-MHC抗原是需要裂解管状细胞的主要作用进一步需要使用植入了器官的所谓“移植物抗宿主反应”即一种对来自供体免疫细胞的受体的强烈反应形成细胞毒性T细胞和抗体以抵抗宿主生物体为了进一步降低移植排斥的危险，在将器官摘除后立即将其冷冻并在器官保护溶液中贮存此外，给该受体服用抑制受体免疫防御的药物在文献中，已经描述了完整系列的器官保护溶液因此，Collins等(Lancet，vol 2，19691219)描述了用于保存器官的胞内电解质溶液Sacks SA(Lancet，vol 1，19731024)描述了具有渗透稳定作用的溶液已经描述了ATP-MgCl2、AMP-MgCl2和肌苷在这类溶液中作为合适试剂(Siegel，NJ等，Am J Physiol，254F530，1983；Belzer等，Transpl Proc 16161，1984)US4,920,004要求保护含有甘露糖醇、腺苷和ATP-MgCl2的溶液US4,798,824和US4,873,230要求保护含有羟乙基淀粉的器官保护溶液在US4,879,283中要求保护含有KH2PO4、MgSO4、腺苷、别嘌呤醇、棉子糖和羟乙基纤维素的溶液它也称作威斯康星大学溶液(＝UW溶液)据记载该溶液可用于成功保存肝、肾和心脏(Jamieson等，Transplantation，vol46，1988517；Ploeg等Transplantation，vol 46，1988191；和Wicomb WN，Transplantation，vol 47，1988733)在US5,200，398中描述了在这类保护溶液中使用葡糖醛酸、其盐和酯类作为其它的添加剂尽管在保护移植器官和抑制不合需要的器官排斥方面获得了成功，但是仍然存在对进一步对其进行改进的需求因此目的是在移植之前的器官保护方面和在移植过程中以及在进一步降低器官排斥的危险方面获得进一步改进通过使用制备用于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类已经实现了这一目的本发明还涉及含有一定量的聚硫酸化糖胺聚糖的器官保护溶液，其中所述的聚硫酸化糖胺聚糖具有至少12.5％的硫含量，该器官保护溶液适于有效维持细胞完整性和细胞存活力的药物制剂例如，也包括器官保护溶液在内的为本发明用途所制备的药物制剂可以含有上述化合物作为其生理活性盐或酯类形式的游离化合物、其互变异构体和/或异构体形式或游离化合物及各种盐的组合形式作为合适的生理上有效的盐值得注意的是例如Na、Ca或Mg盐同样，与类似于二乙胺、三乙胺或三乙醇胺这样的有机碱形成的盐是合适的所述药物制剂可以有利地含有至少一种游离物质或至少一种其盐形式的化合物或它们的混合物用于本发明的聚硫酸化糖胺聚糖类(＝粘多糖类)是带负电荷的多糖类(＝聚糖类)，它们由二糖类的不同连接单元组成，例如，其中类似于D葡糖醛酸或L艾杜糖醛酸这样的所谓糖醛酸的一个分子以糖苷方式与类似于葡糖胺或半乳糖胺这样的氨基糖的第3或4位连接在二糖中至少有一种糖带有可以通过氧原子或氮原子结合的带负电荷的羧酸酯或硫酸酯基团与糖醛酸类以及与硫酸酯基团的糖胺聚糖类的反应是强酸性的这些酸性反应基团实际上已经部分存在而是有价值的以便例如通过以合成方式将硫酸化引入化合物而达到本发明所需的硫酸化程度作为硫酸化方法，文献中描述了作为实例的用硫酸和硫-氯酸的硫酸化(US4,727,063，US，4,948,881)、用硫-氯酸吡啶溶液的硫酸化(Wolfrom等，J Am Chem Soc，1953，75，1519)或用亚硝酸的硫酸化(Shively等，Biochemistry，vol 15 no 18，19763932)其它的方法是本领域技术人员众所周知的实例是类似于肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、软骨素或硫酸软骨素这样的天然糖胺聚糖类的硫酸化用途硫酸乙酰肝素的结构符合肝素的结构，与后者对比其差异在于它具有较少的N和O硫酸酯基和多个正乙酰基糖胺聚糖类可以容易地分离自诸如肠粘膜这样的动物组织或分离自猪和牛的耳例如，使用于分离糖胺聚糖类的组织自溶并将其用强碱提取接下来蛋白质产生凝结物且例如将其通过酸化沉淀在施用所述沉淀的类似于乙醇或丙酮这样的极性非水溶液后，通过用有机溶剂提取而除去脂肪通过蛋白水解消化最终将蛋白质除去而由此回收了糖胺聚糖类例如，Charles等(Biochem J，vol 30，19361927-1933)和Coyne E在Chemistry and Biology of Heparin(Elsevier Publishers，North Holland，NY，Lunblad RL，ed 1981)中描述了用于分离肝素的方法优选可以对分离自然来源的这些糖胺聚糖类通过如在US5,013,724中作为实例所述或如上所述将其聚硫酸化而进行另一种衍生化通过这类聚硫酸化，糖胺聚糖类由此具有的硫含量为6-15％(重量)为了用于本发明或用于药物制剂，选择硫含量至少为12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类优选这类聚硫酸化糖胺聚糖类具有的硫含量为13-16％(重量)、优选13-15％(重量)、特别良好的是13.5-14.5％(重量)将这些物质用于制备适合于抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1的药物制剂优选的是使用生理有效量的这类物质用于治疗和预防与γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1相关的疾病在这些物质的衍生物中，还包括可改进根据它们的作用、稳定性和尤其是它们从体内的消除能力而使用的聚硫酸糖胺聚糖类的应用特性的化合物根据优选情况，应使用具有约1000-2000道尔顿、优选1500-9000道尔顿且特别是2000-9000道尔顿而最佳是2000-6000道尔顿的平均分子量的肝素和/或硫酸皮肤素特别有利的是游离酸形式或与生理上可耐受的碱类形成的盐形式的低分子量聚硫酸化肝素和/或硫酸皮肤素或由这类化合物制备的混合物这类物质具有轻度的抗凝结作用且因此在用于本发明时特别适用于治疗和预防例如，聚硫酸化糖胺聚糖类的优选的盐是钠、钙和镁盐可以通过一系列方法来制备低分子量糖胺聚糖类、例如低分子量肝素和/或硫酸皮肤素例如，EP-B-0 037 319或Biochemistry，vol15，19763932中描述了通过使用亚硝酸解聚来生产低分子量肝素还可以使用下列物质或方法完成低分子量肝素或低分子量糖胺聚糖类的制备酶类(Biochem J，vol 108，1968647)；硫酸和硫氯酸(FR No2,538,404，同时硫酸化)；过碘酸盐或诸如γ照射(EP-A-0 269937)或超声(Fuchs等，Lebensm Unters Forsch，vol 198，1994486-490)这样的物理方法本发明的另外的用途是器官保护溶液通过对器官保护溶液适当施用聚硫酸化糖胺聚糖类可以通过抑制γ干扰素诱导的增量调节MHC I型、MHC II型蛋白质和ICAM 1而进一步提高对从供体生物体中摘除后即来自体内的器官的贮存能力作为本领域技术人员所公知的，优选应将所述器官冷冻如上所述的一系列这样的溶液从文献中已知这些溶液一般含有盐、缓冲液、认为可以以渗透方式使器官稳定或认为可防止氧化的物质诸如糖或糖醇类、蛋白质、氨基酸、低级羧酸类、嘌呤类、嘧啶类或药物活性剂作为这类物质的实例，可提及的是下列物质棉子糖、葡萄糖、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、碳酸氢钾、碳酸氢钠、硫酸镁、氯化镁、腺苷、清蛋白、甘露糖醇、柠檬酸盐、维拉帕米、别嘌呤醇、胰岛素、地塞米松、羟乙基淀粉、谷胱甘肽或葡糖醛酸本发明预计的器官保护溶液的用途可使得以更好的条件移植器官或以比通常的时间期限长的时间期限贮存它们以便可以减少排斥反应成为可能为了进一步降低器官排斥的危害，如果可能，可以在移植前将聚硫酸化糖胺聚糖类经口服或非肠道方式给予移植患者或移植供体在手术后用这些物质治疗患者也是切实可行的器官保护溶液或其它药物制剂中聚硫酸化糖胺聚糖类的含量为10mg/l-10,000mg/l、优选的含量为10mg/l-5000mg/l、更优选的含量为50mg/l-3000mg/l且最优选的含量为100mg/l-3000mg/l另外，5-100g/l含有羟乙基淀粉的渗透稳定物质是有利的进一步有利的器官保护溶液具有下列组成a)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类、5-100g/1羟乙基淀粉和5-100mmol棉子糖；或b)10mg/l-10,000mg/l的硫含量为至少12.5％(重量)的聚硫酸化糖胺聚糖类、5-100g/l羟乙基淀粉、5-100mmol棉子糖、5-40mmol KH2PO4、1-50mmol MgSO4、1-50mmol腺苷、0.5-5mmol别嘌呤醇或1-10mmol谷胱甘肽为了治疗患者，可以将聚硫酸化糖胺聚糖类与常用配方加工物质一起使用可以以通常的口服或非肠道方式(皮下、静脉内、肌内、腹膜内方式)给予用于本发明的药物制剂，其中优选口服或静脉内应用方式剂量取决于患者的年龄、疾病情况和体重以及应用类型糖胺聚糖类最有利的施用剂量为0.1-500mg/kg体重/天就非肠道施用而言，所给予的糖胺聚糖类的最佳剂量为0.1-30mg/kg体重/天；就口服施用而言，剂量为0.2-500mg/kg体重/天，其中可以分一次剂量或几次剂量施用所给予的剂量例如，还可以给予至少一种低分子量肝素和/或其聚硫酸化衍生物和/或至少一种低分子量硫酸皮肤素和/或其聚硫酸化衍生物的混合物，就非肠道应用而言，其剂量为0.1-30mg/kg体重/天；或就口服应用而言，其剂量为0.2-500mg/kg在含有用于治疗和预防与器官移植相关的疾病的聚硫酸化糖胺聚糖类的药物制剂中，主要包括用于口服或非肠道应用的常用盖仑应用剂型，无论它是固体还是液体，诸如片剂、包衣片、胶囊、粉剂、颗粒剂、锭剂、栓剂、溶液或悬浮液可以按照常规方式制备它们可以将活性剂与常用的盖仑加工物质一起进行加工，所述的盖仑加工物质如片剂粘合剂、填充剂、防腐剂、片剂崩解剂、流动调节物质、软化剂、增湿剂、分散剂、乳化剂、溶剂、阻滞剂、抗氧化剂和/或抛射剂气体(参见H Sucker等Pharmazeutische Technologie，Thieme-Verlag，Stuttgart，1991)由此获得的应用剂型含有通常为0.1％-90％(重量)量的活性剂为了生产片剂、包衣片、锭剂和硬胶囊，还可以将聚硫酸化糖胺聚糖类与药物惰性无机或有机赋形剂一起加工作为这类用于片剂、包衣片、锭剂和硬胶囊的赋形剂，还可以使用乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸或其盐就软胶囊而言，植物油、蜡类、脂肪、半固体和液体多元醇适合用作赋形剂为了制备溶液和糖浆，合适的赋形剂是例如水、多元醇、蔗糖、转化糖、葡萄糖等就注射用溶液而言，水、醇类、多元醇、甘油、植物油适合用作赋形剂就栓剂而言，合适的赋形剂是天然或硬化油、蜡类、脂肪、半固体或液体多元醇等药物制剂可以另外含有防腐剂、溶剂、稳定剂、增湿剂、乳化剂、增甜剂、着色剂、芳香剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、保护层和/或抗氧化剂使用Jaffe等所述的方法从新鲜的脐带中回收HUVEC细胞(＝人脐带静脉内皮细胞)(来源于脐静脉的人内皮细胞培养物由形态学和免疫学标准鉴定J Clin Invest 52，19732745-2756)将该过程简述如下通过用胶原酶V消化(Sigma，St Louis MO，37℃下20分钟)从脐带静脉中分离内皮细胞此后，用无菌培养基冲洗静脉并收集内皮细胞该培养基由补充了15％胎牛血清(＝FCS)、内皮细胞生长因子和抗生素青霉素和链霉素的培养基199(Gibco BRL)组成在用1％明胶(Sigma，St Louis MO)包被的25cm2瓶中培养细胞使用从第三至第六细胞培养物传代的细胞进行全部实验通过用因子VIII-相关抗原(Dako，High Wycombe，UK)和内皮标记EN4(CD31)对HUVEC细胞进行阳性染色而表征它们IFNγ刺激、肝素和氯酸钠处理将融合单层PTEC和HUVEC细胞用胰蛋白酶处理并分散在24-孔平板中当达到融合时，将该细胞在有或没有包含在不同肝素内的不同浓度的不同类肝素存在的情况下用IFNγ(Sigma，St Louis MO)刺激72小时，所述的不同肝素诸如来自Braun-Melsungen，Melsungen，Germany的Hepairn-Braun?；来自Pfrimmer Kabi，Erlangen，Germany的低分子量Hepairn Fragmin?P；和来自Knoll AG，Ludwigshafen，Germany的修饰的低分子量肝素在某些实验中，将培养基用氯酸钠补充以便抑制使用细胞结合的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(＝HSPG)的硫酸化氯酸盐的使用浓度为50-150mM在给予IFNγ前24小时向培养基中加入氯酸盐在有氯酸盐存在的情况下用IFNγ进行刺激将氯化钠用作容积克分子的对照在培养后用胰蛋白酶EDTA处理来回收培养的细胞用于流式细胞计量术流式细胞计量术将各种保藏物的细胞放在一起且随后分入两只试管并洗涤对第一只试管给予不与细胞同位素结合且与RPE和FITC(来自Dako，Glostrup，Denmark)和Cy-5(来自Dianowa，Hamburg Germany)连接的抗体将这种保藏物用作FACS背景的阴性对照将第二种保藏物中的细胞用抗MHC I型(RPE缀合的，W6/32，Dako)、抗MHC(MCH)II型(Cy-5缀合的，CR3/43，Dianova)和抗ICAM 1(FITC缀合的，Dianova)的制造商指示浓度的抗体进行标记在4℃下将细胞培养30分钟后，将后者洗涤并用流式细胞计量术(FACScan，BectonDickinson)分析分析了至少10,000个阳性情况将结果表示为平均荧光强度(＝平均荧光强度＝MFI)斑点分析为了进行斑点分析，制备硝化纤维素膜的窄条，对其施用1μl肝素、片段化蛋白和各种其它N脱硫酸化的N乙酰化糖胺聚糖类(＝GAGs，浓度均为1mg/l)干燥后，将这些条状物用1％戊二醛+0.5％鲸蜡基氯化吡啶鎓固定以便防止GAG损失且随后用Tris缓冲液洗涤最终使成品条状物在Kodak胶片上曝光统计学分析使用斯氏T检验测定抗原表达改变的显著性将P值＜0.05看作具有显著性差异结果MHC I型、MHC II型和ICAM 1蛋白质在PTEC中的表达由IFNγ视剂量的不同来调制MHC I型和ICAM 1的表达由浓度为50ng/ml的IFNγ来增量调节此外，使用相同浓度的IFNγ，MHC II型在PTEC中的表达得到了提高(参见附