专利名称:改进的融合产物的制作方法由Kohler和Milstein在1975年所进行的小鼠骨髓瘤细胞与已被免疫的小鼠脾细胞的融合(Nature.256(1975)，495-497)，首次证实了连续获得产生同型(所谓的“单克隆的”)细胞系的可能性以及由这些杂交瘤制造的抗体在各种科学研究和医学珍断上的应用。制备杂交瘤的方法一般包括下列步骤(a)用一种致免疫剂免疫小鼠或大鼠一类动物。所用的免疫方案应该能够产生有用量的适当的已接触抗原的脾细胞。(b)从被免疫的动物体中取出脾脏，在一种合适的介质中制成脾脏悬浮液。(c)在一种合适的融合促进剂存在的条件下，将该悬浮的脾细胞与从一合适的细胞系得来的骨髓瘤细胞进行融合。融合促进剂可以是仙台病毒或是一化学融合剂，如平均分子量约1000至4000的聚乙二醇((PEG)(如商业上可得到的PEG1000等)。另一项有效的融合技术是根据已知方法的电-融合，如Zimmermann和Scheurich(Planta，151(1981)，26-32)、Vienken等(Planta，151(1983)，331)以及Jacob等(Sbud.Biophys，94(1983)，99)等所使用的方法。所用的骨髓瘤细胞系最好是所谓的“抗药”型，以便使未融合的骨髓瘤细胞在选择性培养基上不能存活，而杂种则能存活，最普通的一类是8-氮鸟嘌呤抗性细胞系，由于它缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，从而不能够在HAT(次黄嘌呤、氨基嘌呤和胸苷)培养基中存活。(d)在各个容器中用选择培养基稀释并培养未融合的脾细胞，未融合的骨髓细胞和融合细胞的混合物，这种培养基将不能维持未融合的骨髓细胞以长时间而使未融合细胞死亡(约一周)。稀释可以是一种有限型，其中稀释剂的体积是通过统计学方法计算出来的，以便分离一定量的细胞数(如微量滴定板的每一孔)。在选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞死掉。由于未融合的脾细胞是非恶性的，它们仅有有限的代数，因此，经过一段时间后(约一周)，这些未融合的脾细胞将不能繁殖。而另一方面，融合细胞由于具有骨髓瘤亲本的恶性性质以及脾细胞亲本的在选择培养基上的存活能力，所以能够连续繁殖。(e)鉴定在含有杂交瘤的每一容器(孔)中的上清液中抗体的存在，这种抗体是直接抗最初所使用的抗原的。(f)筛选(如通过有限稀释)和克隆产生所需抗体的杂交瘤。一旦所需的杂交瘤被筛选和克隆，则最终的抗体可以通过两种方式之一产生。最纯的单克隆抗体是在试管中在一种合适的培养基上对所需的杂交瘤进行适当时间的培养而产生的。然后由上清液中回收所需要的抗体。该适宜的培养基和适当的培养周期为已知的或很易确定。这一试管技术生产的基本是单一的单克隆抗体，基本上无其它特定的抗人免疫球蛋白。既然培养基中含有异种血清(如牛胎儿血清)，所以该抗体中有少量的其它免疫球蛋白存在。但是，这一试管方法不能够产生用于某些目的的大量抗体或抗体浓缩物，因为单克隆抗体的浓度仅约50微克/毫升。为了产生在量的纯度稍底的单克隆抗体浓缩物，可以将所需的杂交瘤注射进小鼠中，最好是同源或半同源小鼠。适当培养一段时间后，杂交瘤将引起产生抗体的肿瘤的形成，导致宿主小鼠的血流和腹膜浸出液(腹水)中所需抗体的浓度增高(约为5～20毫克/毫升)。这一方法在文献中已充分公开，它有特别的和严重的缺点。PEG作为融合剂已被越来越多的人所接受，因为其纯品易于得到且在所需的分子量范围内，并且与仙台病毒比较起来它较容易操纵。但是，PEG有效的整个浓度范围非常窄。最佳浓度是50±5%(重量/体积)。在这一浓度下，它表现出对将被融合和已经融合了的所有细胞的细胞毒效应。另一方面，当使用亚最佳浓度的PEG时，仅现定到适度的细胞毒性，但是融合效率以及其后的杂交瘤形成都很低。与仙台病毒相比，已知的化学融合剂如PEG和电-融合不影响被融合的细胞的凝集，因此，细胞膜在紧密贴近处对融合并非直接有效。因此，本发明的目的之一就是提供能够产生有用产物的新型融合杂交细胞。本发明的目的之二是发展一种制备杂交细胞的方法，它是将能够产生有用产物的哺乳动物细胞或植物细胞(如胰岛细胞)与能够连续繁殖的合适的融合配偶体进行融合。本发明的目的之三是要减少常规的化学融合剂的细胞毒作用，这些融合剂包括PEG、溶血卵磷脂、葡聚糖、DMSO(二甲基亚砜)、聚乙烯醇、聚-L-鸟氨酸以及已知有用的盐如硝酸钠或其组合物。在融合方法中，这将导致产生高产量的所需的杂环交细胞。本发明的目的之四是产生将被电-融合技术融合的凝聚细胞。
这些目的以及其它目的将在以下的叙述中清楚可见。从总体上讲，本发明涉及能够产生有用产物的融合杂交细胞，它是将非抗体产生哺乳动物细胞与一种能够连续繁殖的哺乳动物细胞融合而得到的，所说的融合通过首先一起凝聚然后影响凝聚细胞的融合而被简化。从总体上讲，本发明的另一个方面涉及植物细胞的凝聚和融合，以产生能够产生有用产物的杂交细胞。本发明涉及制备一个融合杂交细胞的方法，它是在选择性条件下将能够产生有用产物的非抗体产生的哺乳动物细胞与能够连续繁殖的哺乳动物细胞进行融合，它包括将被融合的细胞混合物与有效量的凝聚原接触，然后进行凝聚细胞的融合。在另一方面，本发明涉及植物细胞的凝聚和融合以产生能够产生有用产物的杂交细胞。本发明进一步涉及制备融合杂交细胞的方法，它包括将能够产生有用产物的植物细胞和能够连续繁殖的植物细胞与有效量的凝聚原接触，然后进行凝聚细胞的融合。
本发明的另一方面是采用已知融合技术将能够产生有用产物的植物细胞的原生质体与能够连续繁殖的细胞(如根癌细胞)的原生质体进行融合，它借助或未借助预先或伴随的凝聚作用的帮助，这些杂交细胞具有产生所需的有用产物的能力。
“凝集原”是一个用于描述任何具有凝集被融合细胞的能力的试剂的术语。虽然它包括所有的凝集原，但典型的凝集原是植物凝集素(PHA)、伴刀豆球蛋白A和花生凝集素。本发明优选的凝集原是PHA。凝集原的浓度应进行调整，使得观察不到细胞毒性作用，而发生明显程度的凝集作用。
凝集原PHA的适当范围是25～400微克/毫升。较好的PHA浓度为约150～200微克/毫升，最好是200微克/毫升。其它凝集原的合适浓度可以采用本领域熟知的标准技术很容易地被确定。凝集作用是在生理温度(如37℃)下经过足够长时间(如5～15分钟)的处理而进行的。充分凝集后，就可进行细胞的融合。在一实施方案中，首先加入常规的化学融合剂(最好是PEG)，然后在生理条件下培养混合物，实现凝集细胞的融合。当使用PEG时，其浓度为约30～50%(重量/体积)。优选的PEG的浓度约为40±5%(重量/体积)。最佳融合时间约为1分钟。时间也可以更长，特别情况下达到2分钟以上，但随着时间的增加，存在着细胞毒性增加的危险。在另一实施方案中，凝集细胞的融合是通过电-融合实现的。
与以前技术所产生的结果相比，本发明的这一新型融合技术导致形成的能存活杂交细胞明显增加。
术语“有用产物”包括被融合的哺乳动物细胞或植物细胞可以产生的所有产物。典型的例子有生物活性蛋白、糖蛋白、多肽、酶和非蛋白质化合物，如生物碱、甾类、薯蓣皂苷配基、蒽醌、除虫菊酯、芳香油、多糖、强心苷、香料和美发油成分。
能够由被融合的细胞产生的生物活性物质的典型例子如下面的表Ⅰ至Ⅴ所示。
表1生物碱 杀虫剂变应原 乳汁蒽醌 脂类抗白血病剂 萘醌抗肿瘤剂 核酸抗病毒剂 核苷酸香料 油苯醌 鸦片制剂碳水化合物(包括多糖) 有机酸强心苷 肽苯基苯乙烯酮 香水双蒽 苯酚酶 色素酶抑制剂 植物生长调节素类黄酮、黄烷酮 蛋白质食用香料(包括增香剂) 甾类及其衍生物萤香豆满酮 糖激素 鞣酸类物萜和类萜维生素表Ⅱ生物活性物质 细胞来源 用途胰岛素 胰岛细胞 抗糖尿病胰高血糖素 胰岛细胞 调节胰岛素的产生生长激素抑制素 胰岛细胞 调节胰岛素的产生促肾上腺皮质激素 垂体前叶细胞 消炎促黄体激素 垂体细胞 调节生殖促滤泡素 垂体细胞 调节生殖生长激素 垂体细胞 促进生长促黄体激素 垂体细胞 调节生育力释放激素促乳素 垂体细胞 刺激产乳促甲状腺素(TSH) 垂体细胞 甲状腺机能减退胸腺激素 胸腺细胞 免疫调谐剂红血球生成素 肾脏 刺激红细胞生成表皮生长因子 颌下腺 促进细胞增殖及抑制胃酸分泌催产素 垂体后叶 控制子宫收缩和产乳后叶加压素 垂体后叶 制尿激素脑啡吠 肾上腺嗜铬细胞 止痛前房Naturietic 心脏细胞 舒张血管因子(ANF)
β-内啡呔 脑，垂体 止痛抑制素 粒膜细胞(卵巢) 控制生育力降钙素用状腺细胞增加骨中Ca++的贮存甲状旁腺激素 甲状旁腺 引起骨的吸收(主细胞)白细胞介素-1 巨噬细胞 抗肿瘤白细胞介素-2 T辅助细胞 抗肿瘤白细胞介素-3 T辅助细胞 干细胞增殖α-干扰素 白细胞 抗病毒，抗肿瘤集落刺激因子-2 T细胞 MQ和粒细胞的增殖集落刺激因子-1 成纤维细胞 MQ的成长和活化B细胞生长因子 T辅助细胞 免疫缺陷肿瘤坏死因子 巨噬细胞 抗肿瘤γ-干扰素 巨噬细胞， 抗病毒和抗肿瘤T辅助细胞β-干扰素 成纤维细胞 抗病毒和抗肿瘤巨噬细胞激活 巨噬细胞 抗病毒和抗肿瘤因子血管原素 癌细胞 伤口愈合，血管形成甾类 肾上腺皮质区 增殖神经生长因子 唾腺细胞 神经元再生血小板衍生 (Endothine 伤口愈合生长因子 血小板)黑素细胞刺激激 松果体细胞 着色控制素和褪黑激素表Ⅲ化合物群 类型及举例药剂 生物碱，甾类，蒽醌酶 蛋白酶(如木瓜蛋白酶)胶乳 类异戊二烯(如橡胶)蜡 蜡酯(如西蒙得木蜡)色素 着色剂和染料油 脂肪酸(如种子油)农用化学品 杀虫剂(如除虫菊酯)美发油物质 芳香油(如单萜)食品添加剂 香味化合物，非营养香料(如Thaumatin)树胶 多糖(如阿拉伯树胶)
表Ⅳ工业 植物产品 植物种 工业应用药剂 可待因(生物碱) 罂粟 止痛药薯蓣皂苷配基(甾类) 三角叶薯蓣 抗生育力剂奎宁(生物碱) 金鸡钠树 抗疟药地谷新(强心苷糖苷) 杀腊毛地黄 强心剂莨菪胺(生物碱) 曼陀罗 抗高血压药长青新碱(生物碱) 长春花 抗白血病药农业化学品 除虫菊酯 除虫菊 杀虫剂食物及饮料 奎宁(生物碱) 金鸡钠树 苦味剂Thaumat in(苯基 Thaumato- 非营养甜味剂苯己烯酮) coccusdanilli美容剂 茉莉 茉莉属 香水表Ⅴ药用试剂 活性 植物来源来自薯蓣皂 抗生育力剂 三角叶薯蓣元的生物碱可待因 止痛药 罂粟阿托品 抗胆碱能药 颠茄利血平 抗高血压药 印度萝芙木(蛇根木)莨菪碱 抗胆碱能药 天仙子地高辛 强心剂 希蜡毛地黄东莨菪碱 抗胆减能药 白花曼陀罗洋地黄毒甙 心血管药 毛地黄匹鲁卡品 胆碱能药 毛果奎尼丁 抗疟药 金鸡纳树来源于哺乳动物的非抗体产生细胞和植物细胞均可使用。植物细胞最好用原生质体的形式。原生质体的形成对于本领域的普通技术人员都是熟知的。
而且，产生除蛋白质外的生物活性物质(如甾类激素)的哺乳动物细胞也可被使用。对于植物细胞，产生生物碱(如奎宁，利血平，柯卡因，阿托品，莨菪胺，毛地黄，吗啡类似物)的细胞均可被使用。
可被利用的细胞还包括那些产生芳香油和香水(麝香酮，灵猫酮，香叶醇以及其它在香水工业上有用的萜类似物质)的细胞。
用作融合配偶体的细胞及使哺乳动物细胞和植物细胞永生的连续繁殖(永久)细胞包括各种来源的骨髓瘤细胞，如来源于小属、大鼠或人的细胞。典型的永久生长细胞是肿瘤细胞，如骨髓瘤细胞，从人瘤形成得到的细胞(包括HeLa细胞)，从咽癌细胞得到的HEP-2，从鼻咽癌细胞得到的KB，类淋巴母细胞，Eppstein-Barr病毒，转化细胞，高繁殖的胚胎细胞，肝癌细胞，肾癌细胞等。本发明中尤其重要的是抗药性骨髓瘤细胞，包括鼠和人的骨髓癌细胞。虽然分泌型可被使用，但一般优选所谓的“非分泌”型。
典型的连续生长植物细胞是根癌细胞，即被根癌土壤杆菌的有毒菌株转化了的植物细胞及其原生质体。
与此相似，本发明也包括了杂交细胞的形成，这种细胞是通过将任何原核或真核型细胞(能够产生有用物质)与任何合适的永生细胞融合而得到的，而不管这种永生细胞是哺乳动物细胞还是植物细胞。
融合细胞在含有常规的碳源、氮源以及微量盐的常规营养培养基上生长和繁殖。繁殖基本上是在需氧条件下进行的，即在95%的氧气和5%的二氧化碳的混合物存在的条件下进行。当然，繁殖过后和所有以前步骤都是在无菌条件下进行的。按照常规方法，可以在同源的或无胸腺的裸鼠中产生大量杂交细胞。这些细胞可以腹水或固体肿瘤的形式收集，且象常规的细胞培养物一样繁殖。可以诱导这些细胞培养物产生大量的所需产物。一个典型的例子是从胰岛细胞得到的杂交细胞的诱导，用葡萄糖诱导这些细胞，就可导致胰岛素产量的增加。与此方式相类似，通过向产生尿激酶的杂交细胞中加入甘氨酸，就可刺激尿激酶的产生。
本发明的尤其重要的和新的特点在于，该方法促进各种杂交细胞的产生，其中的每一种都能在同样的培养基中产生它们自己特有的有用产物。例如(见例1)，从胰脏获得的胰岛细胞(所说的A、B、C、D型细胞的混合物，其中的某些将产生胰高血糖素，另一些将产生生长激素释放抑制因子，还有一些将产生胰岛素等。
由杂交细胞所产生的有用产物可用任何常规方法进行分离，如从杂交细胞除去营养培养基，然后采用提取、逆流分配、亲和层析、沉降、凝胶过滤、离子交换层析、HPLC(高压液体色谱法)等方法。也可将这些方法结合使用。
其产物是熟知的，且进行了鉴定，它们的用途也是熟知的。
下面的实施例对本发明进行了详细说明。
实例1从刚出生的小鼠(一周龄)中取出胰腺组织，收集在盛有10毫升无菌Hank溶液的100毫米平皿中。该胰组织无结缔组织和脂肪，且被绞碎成1×1毫米的小块。在被胶原酶和胰蛋白酶分解前，用无菌盐溶液将其冲洗两次。然后将胰组织转移到一锥瓶中(25毫升)，加入10毫升胰蛋白酶(用盐水配成2.5%的浓度，Gibco)和2毫升的胶原酶(3毫克/毫升，Sigma)，通过温和磁搅拌在37℃培养15分钟，然后弃掉如此得到的上清液。重复胰蛋白酶-胶原酶处理三次，并且将每次得到的上清液在4℃保存。将通过离心(600g)得到的细胞沉淀悬浮在含有16.7mM葡萄糖的30毫升MEM培养基中，该培养基装在10毫米的平皿中。在37℃培养22小时，同时通以95%的氧气和5%的二氧化碳。收集未附着的漂浮胰岛细胞，离心后用Hank溶液冲洗一次，在一无菌试管(15毫升Corning)中将如此得到的胰岛细胞(6×107)与鼠骨髓瘤(Fox-NY)细胞(6×106)混合。通过离心用Hank溶液冲洗细胞混合物一次。轻轻悬浮得到的沉淀，加入0.2毫升的PHA(200微克/毫升)，在37℃将试管培养10分钟。培养完毕后，向试管中加入0.8毫升50%(重量/体积)的PEG(平均分子量1000)溶液，以得到40%PEG的最终浓度。在37℃培养1分钟后，试管中加入10毫升的MEM培养基，再在37℃培养1小时。细胞通过离心冲洗后悬浮于20毫升的HAT培养基中，再以0.2毫升/孔的量将其分散到96孔平板上(Corning)。在CO2培养箱中于37℃培养平板。一周后更换培养基。并且在两周后通过放射免疫测定(RIA)来检测孔中胰岛素的存在。传代培养来维持阳性孔中的细胞。经过48小时的培养后，这一方法获得了24个产生80-200微量单位胰岛素的阳性孔。
在这同一实验中，也通过放射免疫测定(RIA)对这些孔中的生长激素抑制素胰高血糖素进行了检测。通过传代培养和维持阳性孔中的细胞证实了在培养48小时后，有21个含有杂交细胞的孔中产生了300-400毫微微摩尔/毫升的胰高血糖素，有3个含有杂交细胞的孔中产生了约100-500摩尔/毫升的生长激素抑制素。
实例2按照实例1的方法，将从被小棒杆菌处理过的小鼠得到的活化腹膜巨噬细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合。从得到的细胞中筛选白细胞介素-1，γ干扰素，肿瘤坏死因子和巨噬细胞活化因子。最后得到6个产生γ干扰素的孔。产生的γ干扰素约为100-300单位/毫升。
实例3通过混合的淋巴细胞反应，活化从鼠脾脏得到的T-淋巴细胞，然后象实例1所述的那样进行融合。从得到的杂交细胞中筛选白细胞介素2，3和B细胞生长因子。
实例4按实例1融合垂体细胞，然后从得到的杂交细胞中筛选生长激素和促乳素利用激素。
实例5按实例1的方法，将由根癌(由烟草植物的根癌土壤杆菌有毒菌株诱导)制备的原生质体与从印度萝芙木得到的原生质体进行融合。用已建立的方法提取迅速分裂的杂交细胞，以获得利血平。
实例6按照实例1的方法，将从烟草植物的根瘤得到的原生质体与从毛地黄得到的原生质体进行融合，对这样得到的杂交细胞进行提取，以得到毛地黄糖苷。
实例7按照实例1的方法，将从烟草植物的根癌得到的原生质体与从颠茄得到的原生质体进行融合，对得到的杂交细胞进行提取，以得到阿托品。


本发明介绍了新型的改进融合产物。