专利名称：一种降低头孢菌素c分解的方法头孢菌素类药物属于￠-内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成、 加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用。头孢菌素的抗菌部位为其母核7-氨基头孢烷酸 (7-aminocephalosporanic acid, 7-ACA),它是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。由于制备工艺简单、高效、低污染，采用头孢菌素C(&phal0Sp0rin C，CPC)酰化酶一步催化裂解CPC生产7-ACA已经成为发展趋势。产生CPC酰化酶的天然菌株主要为假单胞菌Pseudomonas sp. N176(USP5, 192, 678)和 Pseudomonas sp.SE83 acy II(Matsuda 等 J. Bacteriol.， 1987,169 =5821-5829)等。由于大肠杆菌的基因工程操作简便、高效，采用基因工程大肠杆菌为宿主高表达CPC酰化酶的策略目前使用得最为普遍。目前对CPC酰化酶的研究主要集中在对CPC酰化酶的活性提高和产物耐受性改造。对源于P. diminuta N176的 CPC酰化酶的突变研究表明，一种在215位、296位和309位三个位点发生突变的突变体表现出了更高的 CPC 酶活(Pollegioni L 等 Protein Science, 2005,14 (12) :3064 3076)。对源于Pseudomonas strain SE83acy II的CPC酰化酶进行多点稱合突变提高了酶对底物CPC的活性和特异性，CPC酰化酶酶活相对于野生菌提高8 10倍左右(W0 2005/014821A1)。对底物通道处的氨基酸残基进行突变，可以进一步提高CPC酰化酶的活性(Wang Y 等.Journal of Bioscience and Bioengineering,2012, doi :10.1016/ j. jbiosc.2011.08.027)。重组CPC酰化酶的固定化方法也有公开报道(Zhu X等.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2011, 27 :823-829)。在应用CPC酰化酶催化CPC生产7-ACA的工业化过程中，从基因工程菌中收获的 CPC酰化酶通常经过简单纯化获得粗酶液，再进行固定化获得固定化酶，最后进行CPC催化裂解生成7-ACA的生产过程。研究人员发现，在使用粗酶液催化CPC的过程中，13-15%的底物CPC发生了分解，严重降低了原料利用率，增加了生产成本。使用纯化的CPC酰化酶可以解决对CPC的分解问题，但由此产生的纯化成本显著增加，不符合工业生产的需要。发明人从实验结果和CPC分子的酶分解位点分析出发，发现了 CPC酰化酶粗酶中含有的3 -内酰胺酶和乙酰基酯酶这两种杂酶在特定位点对CPC分子产生裂解作用是导致 CPC分子降解的主要原因。采用基因工程方法无痕叠加敲除宿主菌中的￠-内酰胺酶和乙酰基酯酶基因，获得双酶敲除型基因工程菌。采用该工程菌表达CPC酰化酶，收获的粗酶在催化CPC生成7-ACA过程中，使CPC利用率提高至98%以上。
本发明的目的在于提供一种降低头孢菌素C分解的方法，解决工业酶催化CPC生成7-ACA过程中CPC利用率低的问题。一种降低头孢菌素C分解的方法，首先，采用Red重组系统(Datsenko A and Wanner B, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000,97 (12) :6640-6645)，将宿主菌的 3 -内酰胺酶和乙酰基酯酶基因敲除，然后将头孢菌素C酰化酶基因转化入上述宿主菌，宿主菌表达头孢菌素C酰化酶，然后采用细胞破碎、离心分离的方法制备头孢菌素C酰化酶粗酶液，或者采用细胞破碎、离心分离和固定化方法制备固定化头孢菌素C酰化酶粗酶，将制备的头孢菌素C酰化酶粗酶液或固定化头孢菌素C酰化酶粗酶加入到头孢菌素C底物工作液中催化其生成7-氨基头孢烷酸。所述Red重组系统包含3个辅助质粒，分别为携带卡那霉素抗性基因的 pKD13 (GenBank AY048744)、携带 Red 同源重组酶的 pKD46 (GenBank AY048746)和携带 FLP 重组酶的温敏质粒(CGSC Collection ；Cherepanov PP and Wackernagel ff, Gene. 1995, 158(1) :9-14)。所述宿主菌为大肠杆菌或假单胞菌。所述大肠杆菌为大肠杆菌E. coli JM105(赛百盛公司)、大肠杆菌E. coli JM109 (DE3)(鼎国公司)或大肠杆菌 E. coli BL21 (DE3) (Promega 公司)。所述将头孢菌素C酰化酶基因转化入宿主菌的过程中，需要质粒载体携带头孢菌素C酰化酶基因，所述质粒载体为组成型表达载体或诱导型表达载体。所述组成型表达载体为pMKC质粒表达载体(Zhou H等，Enzyme and Microbial Technology, 2007,40 :555-562)，如携带CPC酰化酶突变体基因的一个组成型表达载体 pMKC-CPCacy(中国发明专利ZL 200810102219. 7);所述诱导型表达载体为pET质粒表达载体，如一种携带CPC酰化酶突变体基因的诱导型表达载体pET28-CPCacy(中国发明专利 ZL 200810102219. 7)。本发明的有益效果(I)无痕叠加敲除宿主菌中的P -内酰胺酶和乙酰基酯酶，获得的基因工程宿主菌用于高表达CPC酰化酶，收获的CPC酰化酶粗酶在进行CPC催化转化的过程中，底物利用率提高约10-13%，显著降低原料成本；(2)本发明操作方法快捷高效，内酰胺酶和乙酰基酯酶在宿主菌中的敲除不影响工程菌的细胞生长和胞内CPC酰化酶的高表达；(3)应用本发明构建的双敲除型基因工程菌作为宿主，表达的CPC酰化酶不需高度纯化即可用于后续步骤，大大简化了生产工艺。图I为CPC在不同条件下的分解现象；其中，I为CPC的自然降解(0. IM Tris-HCl空白缓冲液放置60min，pH8.0，25°C)； 2为大肠杆菌E. coli JM109 (DE3)细胞裂解液对CPC的分解；3为大肠杆菌E. coli JM105 细胞裂解液对CPC的分解；4为大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)细胞裂解液对CPC的分解；5为大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) /pET-CPCacy高表达的CPC酰化酶对CPC的分解。图2为CPC分子结构和可能的酶分解位点；红色虚框表示7-ACA的结构；乙酰基酯酶在位点I产生裂解作用；P -内酰胺酶在位点2产生裂解作用；甲基氧化酶在位点3产生裂解作用；CPC酰化酶在位点4产生裂解作用；D_氨基酸氧化酶在位点5产生分解作用。图3为重组大肠杆菌E. coli JM105的P -内酰胺酶和乙酰基酯酶双敲除；A为￠-内酰胺酶基因ampC的敲除；其中，条带M为DNA分子量标准，分别为5000， 3000，2000，1500，800，500，300bp.条带C为ampC基因敲除前的PCR产物，引物为ampCPl和 ampCP2 ;条带I和2为ampC基因敲除后的PCR产物，引物同上；B为乙酰基酯酶基因aes的敲除；其中，条带M为DNA分子量标准，分别为4500， 3000，2000，1200，800，500，200bp ;条带C为基因敲除前的PCR产物，引物为aesPl和aesP2. 条带I和2为基因敲除后的PCR产物，引物同上。C为基因ampC敲除疤痕“scar”的测序验证；基因敲除工程菌为E. coli JM105 (AampC)。部分 ampC(1190bp)基因被 87bp “scar” (携带 FRT1,FRT2 和卡那霉素残余片段)替代；D为基因aes敲除疤痕“scar”的测序验证；基因敲除工程菌为E. coli JM105 ( A ampC, A aes)。部分 aes (1256bp)基因被 87bp “scar”(携带 FRTl，FRT2 和卡那霉素残余片段)替代；DNA测序序列分析采用Chromas软件。图4为双酶敲除工程菌的细胞生长和细胞裂解液对CPC的分解；k为coli JM105及@ -内酰胺酶和乙酰基酯酶敲除工程菌的细胞生长曲线；符号表示为■，E. coli JM105 ; ，E. coli JM105 (Aaes) ;▲，E. coli JM105( AampC) ；▼, E.coli JM105 ( A ampC, A aes)；B为E.coli JM105及￠-内酰胺酶和乙酰基酯酶敲除工程菌细胞裂解液对CPC的分解；各数字的含义为1，CPC的自然分解；2，E.coli JM105细胞裂解液；3， E.coli JM105(Aaes)细胞裂解液；4，E. coli JM105 ( A ampC)细胞裂解液；5，E. coli JM105 ( A ampC, A aes)细胞裂解液。图5为CPC酰化酶在组成型基因敲除工程菌中的表达及粗酶液对CPC的分解；A为培养24小时的各菌株全细胞SDS-PAGE蛋白质电泳图；条带M，蛋白质分子量标准，分别为 170，130，95，72，55，43，34，26，17 和 IOkDa ;条带 1，E. coli JM105/pMKC-sCPCacy ；条带 2，E.coli JM105( A aes)/pMKC-sCPCacy ；条带 3，E.coli JM105 ( A ampC) /pMKC-sCPCacy ;条带 4，E. coli JM105( AampC, A aes) /pMKC-sCPCacy ；B为双酶敲除前后CPC酰化酶粗酶液对CPC降解的比较；对照I，Ni2+金属亲核层析纯化后的 CPC 酰化酶;2-5，分别为 E. coli JM105/pMKC-sCPCacy,E. coli JM105(Aaes)/ pMKC-sCPCacy, E. coli JM105 ( A ampC)/pMKC-sCPCacy 和 E. coli JM105( AampC, Aaes)/ pMKC-sCPCacy收获的粗酶液。

0.IM Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)洗涤两次后重悬于IOmL缓冲液中，冰浴超声IOmin (320W， 3X3X60次)；4°C离心获取上清，即为细胞裂解液。采用同样的方法，在诱导型培养基中培养大肠杆菌BL21(DE3)/pET28-CPCacy(中国发明专利ZL 200810102219. 7)并诱导CPC酰化酶表达。采用同细胞裂解液同样的步骤进行处理，收获的上清液为CPC酰化酶粗酶液。(2)细胞裂解液中杂酶对CPC的降解作用用0. IM Tris-HCl 缓冲液(pH 9. 0)配制40g. lAPC溶液，用 IM NaOH调至pH 8. O。 取100 i! L CPC溶液与100 u L细胞裂解液或CPC酰化酶粗酶液混合，并以CPC溶液加等体积的0. IM Tris-HCl缓冲液(pH 8. 0)为对照，25°C温浴60min后加入600 u L终止液(50mM NaOH与20%冰醋酸I : 2混合)，并置于冰中，pH保持8. O。在13000rpm离心I 2min后取500 u L处理后上清用0. 05M磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液，pH 8. 0) I. 5mL稀释后移至7mL离心管并置于冰中。取500 ill进行HPLC分析(色谱条件phenomenex C18柱，150X4. 6mm ； 流动相15 %甲醇，7. 5%乙腈，I %乙酸；254nm检测吸光度)，测定CPC的残留量。结果表明，空白对照中CPC的自然降解率小于2 %，CPC酰化酶粗酶液则由于CPC酰化酶的存在，而将所有的CPC全部分解。而大肠杆菌E.coli JM105，JM109(DE3)和BL21(DE3)的细胞裂解液中虽然不存在CPC酰化酶，但仍然对CPC产生了明显的降解。三株菌对CPC的降解作用基本相当，约为13^-15% (如图I所示)，说明在细胞裂解液中存在其它杂酶，对CPC产生了分解作用。(3)分解CPC的杂酶的确定根据CPC 的分子结构(Fisher J 等 Chem. Rev.，2005，105，395-424.)和微生物酶的功能分析，推定CPC分解的主要原因在于母核7-ACA结构的降解。如图2所示的位点I、 位点2和位点3，分别被乙酰基酯酶、￠-内酰胺酶和甲基氧化酶裂解。由于甲基氧化酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)辅酶依赖型，由cmcl和cmcj两个基因编码，因此推测产生 CPC分解作用的主要杂酶为乙酰基酯酶和￠-内酰胺酶。实施例2^ -内酰胺酶和乙酰基酯酶在E. coli JM105和JM109 (DE3)中的敲除(I) ^ -内酰胺酶基因ampC的敲除对大肠杆菌E. coli K12的基因组序列分析表明，在E. coli JM105和JM109(DE3) 的基因组中同时存在￠-内酰胺酶基因ampC(E. coli K12 gene ID948669)和乙酰基酯酶基因 aes(E.coli K12 gene ID 947514)。设计同源臂引物对 ampCPl/ampCP2，分别包含 40bp 的ampC基因上下游片段和19bp的卡那霉素抗性基因片段，由英潍捷基生物工程技术有限公司(北京)合成。以辅助质粒PKD13为模板，扩增内部为卡那霉素抗性基因，外部为ampC 同源臂的DNA片段。PCR扩增采用50 UL体系，组成如下


本发明属于生物工程技术领域的一种降低头孢菌素C分解的方法。采用Red重组系统，将宿主菌的β-内酰胺酶和乙酰基酯酶基因敲除，然后将头孢菌素C酰化酶基因转化入上述宿主菌，宿主菌表达头孢菌素C酰化酶，然后制备头孢菌素C酰化酶粗酶液或固定化头孢菌素C酰化酶粗酶，加入到头孢菌素C底物工作液中催化其生成7-氨基头孢烷酸。采用本发明的方法制备的CPC酰化酶，收获的粗酶在催化CPC生成7-ACA过程中，使CPC利用率提高至98％以上。