专利名称：重组大分子生成方法重组大分子生成方法药学和生物技术研究中对重组大分子很感兴趣且所述重组大分子包括核酸(核糖和脱氧核糖核酸)和蛋白。其中，重组蛋白由于其多样性和众多应用而受到最多关注。药学和生物技术研究的某些方面取决于重组大分子生成。这种重组大分子在多种宿主细胞中生成，所述宿主细胞包括但不限于细菌细胞(如大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。许多情况中，所述重组大分子在异源宿主细胞中生成，即不同于大分子天然来源的宿主细胞。例如，生物技术药物人生长激素是来自人脑下垂体的分泌蛋白，其在细菌大肠杆菌(E.coli)中重组生成。这种异源宿主细胞系统不总能成功地生成所需重组大分子。所需蛋白往往会在异源宿主细胞中错折叠(即没有其天然结构并因而无功能)，或以不可溶、毒性、聚集或降解的形式表达。通常所述重组大分子在异源宿主细胞中以不充足量简单生成。经修饰重组蛋白或重组融合蛋白还可能由于其非天然组成而造成生产难题，即使在同源宿主细胞系统中。解决重组大分子生产的上述难题的一种通用方法是使用替代宿主细胞系统。然而，某些大分子生产问题如错折叠蛋白在宿主细胞系统中生成以后进行解决，这可能耗费劳力且并不对所有蛋白都有效。另外，解决这些问题一般是蛋白特异方法，导致低通量。解决某些大分子生产问题的另一方法涉及使用无细胞的蛋白表达系统。这些系统的一种实践限制在于其不能缩放。无细胞表达系统的蛋白生产极限一般是50毫克或更少，通常生产极限仅为数毫克。另外，细胞提取物和细胞裂解物的存储导致其生成蛋白的能力降低。这些系统也不具有生成显著量核酸的有意义能力并因此需要二级系统来提供必需DNA模板的供应。
一方面，提供了在宿主细胞中重组表达大分子的方法。此方法包含培养宿主细胞直到达到合适细胞密度，所述宿主细胞含编码透膜剂的核酸序列和编码所需大分子的核酸序列，两种序列在各自的 调节序列控制下。此步骤中，透膜剂在细胞内生成。一方面，所述方法涉及使宿主细胞暴露于诱导透膜剂破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜的环境条件。之后，给细胞提供营养混合物，其中含有能经由已破坏的细胞膜转运的小分子量组分。这些组分可包括诱导启动子指导所述大分子表达的诱导剂，和允许所述大分子在膜破坏的宿主细胞中表达的充分代谢必需品。此方法使所述大分子能在宿主细胞内以正确构象和/或所需量表达。在某些实施方式中，所述细胞在任何诱导环境条件和接触营养混合物前浓缩。在其他实施方式中，接触营养混合物和诱导所述大分子表达后的细胞进行裂解并收获所述大分子。另一方面，提供了在宿主细胞中提高大分子重组表达的方法。此方法涉及使达到合适细胞密度的宿主细胞接触透膜剂，所述宿主细胞含严格调节启动子控制下编码所述大分子的核酸序列。所述透膜剂外部应用于细胞培养物且破坏细胞膜完整性而不完全裂解该膜。之后，给细胞提供营养混合物，其中含有能经由已破坏的细胞膜转运的小分子量组分。这些组分可包括诱导启动子指导所述大分子表达的诱导剂以及允许所述大分子在膜破坏的宿主细胞中表达的充分代谢必需品。此方法使所述大分子能在宿主细胞内以正确构象和/或所需量表达。在某些实施方式中，所述细胞在接触透膜剂和营养混合物前浓缩。在其他实施方式中，接触营养混合物和诱导所述大分子表达后的细胞进行裂解并收获所述大分子。另外一方面，一种原位药物筛选方法涉及使用上述重组生成所需大分子的一种或另一种方法。一方面，所述方法涉及在微孔板的各孔中培养上述含两种核酸序列的宿主细胞。在一个实施方式中，各孔包含编码相同大分子的核酸序列。在另一个实施方式中，各孔包含编码不同的类似大分子的核酸序列，如变体大分子库的一员。在另一个实施方式中，各孔包含编码不同大分子的核酸序列，如基因组库。然后，如上所述使各孔中的这些宿主细胞暴露于适合诱导细胞中透膜剂表达以破坏细胞膜完整性而不完全裂解该膜的环境条件。各孔中宿主细胞在上述营养混合物存在下培养，引起各孔的宿主细胞中表达大分子。在各孔包含相同已表达大分子的一个实施方式中，向各孔应用不同的测试剂。在各孔表达不同大分子变体或不同大分子的另一个实施方式中，向各孔应用相同的测试剂。随后使用常规试验如ELISA、质谱等能在一个实施方式中确定响应单一测试剂的大分子的特性,或在另一方面确定诱导相同大分子响应的测试剂的特性。另外一方面，原位药物筛选涉及如上所述外部应用透膜剂/大分子生成方法的用途。此方面中，所述筛选还涉及使各孔的细胞暴露于外部应用的透膜剂，可选有其他环境条件。之后，以本文所述的相同方式，将测试剂应用于`孔并进行测试。这些方法的其他方面和优势进一步描述于下文优选实施方式的详细描述。发明详述本发明是生成重组大分子的方法，所述重组大分子原本可能由于不合适的结构、毒性、不溶性、新构成物或不充足量而难以在宿主细胞系统中生成。下面详细描述的各方法涉及用透膜剂处理能生成所需重组大分子的宿主细胞以破坏宿主细胞膜完整性，然后使宿主细胞暴露于足以生成所需重组大分子的条件。1.重组生成大分子的方法根据本文所述方法，审慎处理表达选定大分子的宿主细胞的细胞膜进行以使所述大分子能大量表达且构象正确。细胞膜的完整性是维持细胞膜透过屏障(控制分子转运到细胞内部)、其划分功能(使细胞能维持不同于外部环境的内部环境)、和其能量产生能力(提供细胞能量源用于其代谢活性)所必需的。所有这些功能都是细胞维持其代谢活性所必需，包括大分子生成。若细胞膜的完整性受到充分影响，大分子生成会终止。细胞膜透过屏障使某些分子能通过两种基本机制:主动和被动转运而进入细胞内部。主动转运是需要能量的过程，能在选择性转运复合体帮助下逆浓度梯度(低到高浓度)转运分子以促进特定分子进入细胞内部。这些转运复合体是特异性的且可饱和，因此其跨细胞膜递送多种分子的能力受限。另一方面，被动转运不需要能量源且一般产生顺浓度梯度(高到低浓度)向下转运分子。被动转运通常通过两种基本机制:简单扩散和受促扩散其中之一来跨细胞膜运输非水分子。简单扩散中，分子通过随机运动从高浓度区域向低浓度区域移动。然而，存在细胞膜时不是所有分子等同跨膜扩散。跨细胞膜简单扩散的限制性标准可包括分子大小、电荷或溶解度。另一方面，受促扩散利用选择性复合体顺浓度梯度向下跨细胞膜转运分子。尽管转运机制的多样性显著，由于细胞膜的选择性渗透性，不是所有分子都等同进入细胞内部。根据本方法，降低细胞膜选择性使更多样性的分子能跨细胞膜扩散进入细胞内部以用于提高所插入大分子表达系统表达的目的。细胞膜还能使细胞维持不同于外部环境的内部环境。分隔这两种环境能使细胞产生有助于其许多代谢反应的最优胞内环境，这些代谢反应包括蛋白合成、核酸合成和能量生成。胞内环境相比胞外环境的具体差异包括pH、盐浓度、渗透压、溶质浓度和还原-氧化(氧化还原)电势。根据本文详细描述的本方法，破坏细胞膜完整性能平衡细胞内部和外部环境。最后，细胞膜可通过维持跨膜pH差异和膜电位(跨膜电荷差)为细胞提供潜在能量源。电荷差是缘于质子隔离时，势能称为质子动力。某些细胞中，质子动力能间接导致ATP生成，ATP是细胞的关键化学能量源。本方法通过膜透化引起膜电位丧失，从而消除能化膜功能。因此，通过营养混合物·中提供的替代能量源来外部供给宿主细胞代谢活性。本方法操纵细胞膜通透性以提高选定大分子的生成。本发明的一个实施方式提供在宿主细胞中重组表达大分子的方法。所述方法包含培养宿主细胞至足以符合所需大分子生成水平的细胞密度，所述宿主细胞含有第一核酸序列和第二核酸序列，所述第一核酸序列在第一调节序列操作性控制下编码透膜剂，所述第一调节序列指导宿主细胞中所述透膜剂的表达；所述第二核酸序列在含严格调节启动子的第二调节序列操作性控制下编码所述大分子，所述第二调节序列指导宿主细胞中所述大分子的表达。在此实施方式中，所述方法使宿主细胞暴露于诱导透膜剂破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜的环境条件，从而能通过膜转运小分子量化合物。在此实施方式中，所述方法包括在营养混合物存在下培养宿主细胞，所述营养混合物包含能通过已破坏细胞膜转运的组分，所述组分包含诱导第二调节序列启动子的诱导剂和允许所述大分子在膜破坏的宿主细胞中表达的代谢必需品。本发明的另一方面提供增强宿主细胞中大分子重组表达的方法。所述方法包含使宿主细胞以合适的细胞密度接触破坏细胞膜完整性而不完全裂解所述膜的透膜剂，并能通过所述膜转运小分子量化合物，所述宿主细胞包含在严格调节启动子的调节序列操作性控制下编码所述大分子的核酸序列，所述调节序列指导宿主细胞中所述大分子的表达。所述方法还包括在营养混合物存在下培养宿主细胞，所述营养混合物包含能通过已破坏细胞膜转运的组分，所述组分包含允许所述大分子在膜破坏的宿主细胞中提高表达的代谢必需品。I1.大分子生成方法的组件除非本说明书中另有定义，本文所用技术和科学术语具有的含义与本发明所属领域普通技术人员和参考已出版教材通常理解的相同。尽管本说明书或权利要求中的多个实施方式在多种情况下用语言“包含”表示，相关实施方式还可用语言“由……组成”或“基本由……组成”描述。应注意到术语“一”或“某”指一种或多种，例如“ 一种化合物”应理解为表示一种或多种化合物。如此，术语“一”(或“某”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中互换使用。A.宿主细胞术语“宿主细胞”指源自以单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的细胞，其可用作或已用作重组载体的受体。所述术语包括已转染原始细胞的后代。应理解由于偶然或有意突变，单一亲本细胞的后代在形态或基因组或总DNA互补性方面不必与原始亲代的完全相同。所述定义包括且上述术语涵盖亲本细胞的由相关特性如存在编码生物合成酶的核苷酸序列所表征与亲本充分相似的衍生物/后代。合适的宿主细胞易由本领域技术人员选择。可用于本方法的宿主 细胞包括细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。可用于此方法的合适宿主细胞或细胞系包括细菌细胞。例如，熟知大肠杆菌(E.coli)的多种菌株(如HBlOU MC1061、MM294、W3110、BL21和用于下列示例的菌株)为生物技术领域中的宿主细胞。此方法还使用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomyces)和其他杆菌等的多种菌株。使用哺乳动物细胞如人293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、猴细胞系C0S-1和Veix)、骨髓瘤细胞系NSO或者源自Swiss, Balb-c或NIH小鼠的小鼠3T3细胞。另一合适的哺乳动物细胞系是CV-1细胞系。本领域已知其他合适的哺乳动物宿主细胞以及转染、培养、扩增、筛选、生产和纯化的方法。(参见例如 Gething 和 Sambrook, 1981Nature293:620-625,或另外,Kaufman 等,1985Mol.Cell.Biol.,5(7): 1750-1759或Howley等，美国专利4，419，446)。本领域技术人员已知的许多酵母细胞菌株也可用作表达本发明多肽的宿主细胞。其他真菌细胞也用作表达系统。或者，可使用昆虫细胞如草地贪夜蛾(Spodoptera frugipedera) (Sf9)细胞。B.透膜剂(“试剂”)已知一些分子实体或环境条件影响细胞膜通透性且在合适条件下能破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜。可用于本发明的透膜剂名单包括但不限于细菌蛋白毒素和其已知与细胞膜相互作用的变体(如白喉毒素、炭疽保护性抗原、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A、肉毒杆菌毒素、破伤风毒素、霍乱毒素、金黄色葡萄球菌(S.aureus) a毒素、0桶成孔毒素、大肠杆菌溶血素、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens) i毒素、李斯特菌溶血素O、细胞溶素)；植物蛋白毒素和其已知与细胞膜相互作用的变体(如蓖麻毒素、相思豆毒素、蒴莲素)；通道蛋白(如离子通道、电压调控通道、化学调控通道、未调控通道)；被动转运蛋白；小型成孔分子，包括肽(如制霉菌素、两性霉素B、短杆菌肽A、丙甲菌素)；酶(如脂肪酶)；间隙连接蛋白；核孔复合物；成孔蛋白(如孔蛋白)和穴蛋白；大肠杆菌素(如大肠杆菌素E1、大肠杆菌素E3、大肠杆菌素A、大肠杆菌素la、大肠杆菌素Y);抗菌肽(Protegrin);补体和补体相关蛋白(如穿孔素)；膜融合病毒蛋白(如血凝素)；Bcl-2蛋白；去污剂，包括SDS、曲通(Triton)-X、CHAPS、脱氧胆酸、正辛基-B-D-吡喃葡萄糖苷、吐温(TWEEN)和曲通-X ;渗透压试剂，包括甘油、聚乙二醇和葡聚糖；前面列举的肽、多肽和蛋白的变体。“变体”指相较未修饰“前体”或“亲本”核酸、多肽或蛋白，氨基酸或核酸序列有变化的核酸、肽、多肽或蛋白，无论该变化是核酸或氨基酸的缺失、插入、添加或者取代。未修饰前体或亲本可以是天然产生或野生型核酸、肽、多肽或蛋白，或变体核酸、肽、多肽或蛋白。修饰蛋白的序列通过亲本序列的取代、缺失或插入一个或多个核酸或氨基酸而“源自”前体或亲本序列。白喉毒素(DT)和其某些分子变体是能在细胞膜中形成条件依赖性孔的蛋白。DT蛋白包含3个结构域:催化(C)、转位(T)和受体结合(R)结构域。DT蛋白经R结构域结合培养中的贴壁哺乳动物细胞(如猴细胞、中国仓鼠细胞)，所述细胞随后暴露于弱酸性环境(约PH4-5.5)，所述蛋白经历构象变化使插入邻近细胞膜的T结构域中的隐藏氨基酸序列暴露。T结构域的膜插入充分破坏细胞膜完整性以使C结构域能跨越细胞膜并进入细胞内部。膜破坏水平取决于所用DT浓度和暴露pH。合适DT浓度下，膜插入和破坏不裂解细胞。在本发明的一个实施方式中，透膜剂是白喉毒素。在另一实施方式中，透膜剂是减毒白喉毒素。在本发明的另一个实施方式中，透膜剂是DT-E148S。DT-E148S是所含C结构域活性减弱约500倍的白喉毒素(DT)低毒变体。在大肠杆菌中带前导序列克隆时，所述蛋白分泌到周质空间。这类细胞暴露于酸性环境(约PH4-6.5)时，周质空间的pH降低且周质DT-E148S蛋白部分插入大肠杆菌细胞膜。此插入破坏许多内膜功能，包括主动转运、膜电位和离子不渗透性。膜功能破坏显示细胞膜完整性损失，但显微镜观察显示细胞尚未裂解而仍完整。此外，细胞保留大分子如细胞质酶，但细胞确实变得允许紫外线吸收性小分子自由透过。可用于本文所述方法的DT毒素变体描述于文献中。用于本发明的一些这类变体包括但不限于:C结构域变体，包括催化活性减弱的E148D、E148Q、E148S，描述于Wilson等，Biochemistry29:第8643-8651页(1990)。特别需要改变位置148处谷氨酸的变体。可用于本发明的其他变体包括催化活性减弱的H21A、H21D、H21L、H21Q、H21R，描述于Blanke等，Biochemistry33:第 5155-5161 页(1994)。其他 DT 变体包括缺失残基 148、148-147、148-146、148-145或148-144从而引起催化活性降低的那些。参见Killeen等，PNAS89:第6207-6209页(1992)。其他DT变体包括含S508F和S525F的R结构域变体，S508F和S525F减弱毒素结合并因而降低其毒性，如Greenfield等，Science274，第209-219页(1987)所述。其他变体包括减弱受体结合的K516A和F530A,如Shen等，Journal of BiologicalChemistry269:第29077-29084页(1994)所述。其他变体包括在一个或多个下列残基处有突变和 / 或缺失的 DT:S381、H384、H391、R462、D465、D467、S506、D507、Q515、K516、D519、K526、A430、 L433、L464、V468、F470、L512、N524、F530、S508、S528 和 S505,如 Louie等，Molecular Celll:第67_78页(1997)所述。其他变体包括T结构域变体，包括含氨基酸202-378 的 DT 片段，其进一步描述于 Zhan 等，Biochemistry34:第 4856-4863 页(1995)。可用于本发明的其他变体包括称为交叉反应材料(CRM)的DT变体(交叉反应性定义为免疫交叉反应性)。可用于本发明的CRM包括但不限于含使其为低毒性的G52E突变的CRM197 ；和缺乏R结构域但具有T结构域且能破坏膜的DT截断突变体CRM45。可用于本发明的其他变体包括缺乏R结构域的DT变体。在透膜剂由宿主细胞表达的一个实施方式中，所述试剂优选为蛋白。或者，在外部应用试剂的另一个实施方式中，所述透膜剂是非蛋白质化合物。在一个实施方式中，可由宿主细胞表达的透膜剂能替代性地外部供应。例如，所述透膜剂DT可外部提供给哺乳动物细胞。这种情况中，应用的DT量取决于宿主细胞系和pH。例如，更高pH下可提供更多的DT，但更低pH值下会需要更少的DT。在一个实施方式中，提供10_6-10_9摩尔DT。在一个实施方式中，对于微生物宿主细胞如大肠杆菌和酵母，需要用标准酶促和化学过程部分或完全去除宿主细胞壁，以产生能在渗透上稳定的原生质球。然后，应用外部透膜剂如DT。在一个实施方式中，DT以10_4-10_8摩尔的浓度应用。在另一个实施方式中，所述透膜剂是大肠杆菌素且所述试剂以10_6-10_9摩尔的浓度应用于大肠杆菌。C.小分子量化合物这些方法中，共表达或外部应用透化剂的通透作用的结果是此时某些小分子量分子能跨细胞膜自由转运。这些小分子量化合物大小范围为约50-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约75-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约100-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约150-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约200-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约250-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约350-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约450-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约550-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约650-约2000道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约50-约1750道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约50-约1500道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约50-约1250道尔顿。在一个实施方式中，所述小分子量化合物大小范围为约50-约1000道尔顿。在一个实施方式中，能穿过透化细胞膜的化合物为约30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200、225、250、300、350、400、450、500、550、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400 或2500道尔顿。D.大分子可用本发明表达系统生成的大分子包括但不限于:肽包括多肽和蛋白，DNA和RNA。感兴趣大分子的功能不受本方法限制。可用于本发明的蛋白包括但不限于:生物活性分子如用于疾病的治疗剂(如胰岛素、干扰素、白介素、肽激素、抗血管生成肽)；结合并影响特定细胞靶标如受体、通道、脂质、胞质蛋白和膜蛋白的肽；对特定物质(如生物组织、生物分子)有亲和性的肽，等等。可用本发明方法表达的核酸包括但不限于DNA、RNA、反义DNA、mRNA、tRNA、rRNA、tmRNA、siRNA、miRNA、反义 RNA、ncRNA、snRAN、snoRNA 和 dsRNA。本发明的其他有用大分子包括治疗产品。这些包括激素和生长及分化因子，包括但不限于:胰岛素、胰高血糖素、生长激素(GH)、甲状旁腺素(PTH)、生长激素释放因子(GRF)、促滤泡激素(FSH)、促黄体激素(LH)、人体绒毛膜促性腺激素(hCG)、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素、血管抑素、粒细胞集落刺激因子(GCSF)、红细胞生成素(EPO)、结缔组织生长因子(CTGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(I3DGF)、胰岛素生长因子I和II (IGF-1和IGF-1I)，转化生长因子a超家族中的任何一种，包括TGFa、激活素、抑制素，或骨形态发生蛋白(BMP)BMP1-15中的任何一种，生长因子中的调蛋白/神经调节蛋白/ARIA/neu分化因子(NDF)家族的任一种、神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子NT-3和NT-4/5、睫状神经营养因子(CNTF)、胶质细 胞性衍生神经营养因子(⑶NF)、神经秩蛋白(neurturin)、聚集蛋白，信号素/脑衰蛋白j家族中的任何一种、轴突导向因子(netrin)-l和轴突导向因子_2、肝细胞生长因子(HGF)、肝配蛋白、头蛋白、音猬因子(sonic hedgehog)和酪氨酸轻化酶。其他有用的大分子包括调节免疫系统的蛋白，包括但不限于:细胞因子和淋巴因子如促血小板生成素(TPO)，白介素(IL)IL-1到IL-25(包括例如IL-2、IL_4、IL-12和IL-18)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子a和￠,干扰素a、0和Y、干细胞因子，flk_2/flt3配体。免疫系统生成的基因产物也可用于本发明。这些包括但不限于:免疫球蛋白IgG、IgM、IgA、IgD和IgE、嵌合免疫球蛋白、人源化抗体、单链抗体、T细胞受体、嵌合T细胞受体、单链T细胞受体、MHCI和II型分子以及工程改造的免疫球蛋白和MHC分子。有用的大分子还包括补体调节蛋白如补体调节蛋白、膜辅助蛋白(MCP)、衰变加速因子(0么 )、0 1、0 2和0059。其他有用的大分子包括激素、生长因子、细胞因子、淋巴因子、调节蛋白和免疫系统蛋白的受体中任何一种。本发明涵盖胆固醇调节和/或脂质调节的受体，包括低密度脂蛋白(LDL)受体、高密度脂蛋白(HDL)受体、极低密度脂蛋白(VLDL)受体、和清道夫受体。本发明还涵盖基因产物如留类激素受体超家族成员，包括糖皮质激素受体和雌激素受体、维生素D受体和其他核受体。另外，有用的基因产物包括转录因子如jun、fos、max、mad、血清反应因子(SRF)、AP-1、AP2、myb、MyoD和肌细胞生成素、含ETS盒蛋白、TFE3、E2F、ATFl、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNF_4、C/EBP、SP1、CCAAT 盒结合蛋白、干扰素调节因子(IRF-1)、肾母细胞瘤蛋白、ETS结合蛋白、STAT、GATA-盒结合蛋白如GATA-3、以及翼状螺旋蛋白叉头豕族。其他有用的大分子包括氨甲酰合成酶1、鸟氨酸转氨甲酰酶、精氨琥珀酸合成酶、精氨琥珀酸裂解酶、精氨酸酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶、苯丙氨酸羟化酶、a -1抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、胆色素原脱氨酶、胱硫醚3合成酶、支链酮酸脱羧酶、白蛋白、异戊酰CoA脱氢酶、丙酰CoA羧化酶、甲基丙二酰CoA变位酶、戊二酰CoA脱氢酶、胰岛素、P -葡糖苷酶、丙酮酸羧化酶、肝磷酸化酶、磷酸化酶激酶、甘氨酸脱羧酶、H蛋白、T蛋白、囊性纤维化跨膜调控子(CFTR)序列、和抗肌萎缩蛋白基因产物[如小抗肌萎缩蛋白或微抗肌萎缩蛋白]。其他有用的大分子包括酶如可用于酶替代治疗的酶，其用于酶活性缺乏引起的多种病症。例如，含甘露糖-6-磷酸的酶可用于治疗溶酶体贮积疾病(例如合适基因包括编码 葡萄糖醛酸糖苷酶(⑶SB)的)。其他有用的大分子包括用于治疗血友病的那些，包括B型血友病(包含因子IX)和A型血友病(包含因子VIII和其变体，如异二聚体的轻链和重链以及缺失B的结构域)。编码上述任何蛋白的核酸序列能用重组方法或从已知含相同核酸的载体衍生序列而获得。此外，所需序列能从所含相同序列的细胞和组织中直接分离，使用标准技术如酚提取和cDNA或基因组DNA的PCR[参见例如Sambrook等]。核苷酸序列还能合成产生,而不是克隆产生。完整序列能从标准方法制备的重叠寡核苷酸来组装并装配成完整编码序列[参见例如 Edge, Nature292:757 (1981) ; Nambari 等,Science, 223:1299 (1984);和 Jay等，J.Biol.Chem.259:6311 (1984)]。其他有用的大分子包括非天然产生的多肽，如嵌合或杂合多肽，所述多肽具有含插入、缺失或氨基酸取代的非天然产生氨基酸序列。其他类型的非天然产生基因序列包括反义分子和催化性核酸如 核酶，其能用于减少靶标过表达。合适的大分子易由本领域技术人员选择。E.核酸序列、分子或转运载体的组装为用于本文所述方法，将选定大分子和透膜剂之一或两者作为核酸序列或分子感染、转化或转染到选定宿主细胞中。例如，一种方法中，第一核酸序列在第一调节序列操作性控制下编码透膜剂，所述第一调节序列指导宿主细胞中所述试剂的表达。在另一个实施方式中，核酸序列(根据所用方法可称为第二核酸序列或分子)在含严格调节启动子的调节序列(或第二调节序列)操作性控制下编码所述大分子，所述调节序列指导宿主细胞中所述大分子的表达。编码大分子或细胞透化剂的核酸序列使用本领域熟知技术克隆到合适表达载体内。参见例如上面引用的Sambrook。本文所用的术语“质粒”、“载体”、“转运载体”和“表达载体”指通常携带基因且常为环状双链DNA分子形式的染色体外元件，所述基因不是细胞中心代谢的一部分。这种元件 可以是获自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列被连接或重组成独特构造，所述构造能将用于选定基因产物的启动子片段和DNA序列以及合适的3’未翻译序列引入细胞。这种载体选自本领域已知的常规载体类型，包括昆虫如杆状病毒表达，或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。本领域已知其多种类型的其他合适表达载体也能用于此目的。熟知获得这种表达载体的方法。在本发明的一个实施方式中，第一核酸序列或第二核酸序列在转运载体中独立存在，所述载体是质粒、噬菌体或病毒。在优选的实施方式中，所述载体是有选择标记的质粒，如抗生素抗性基因。参见上面引用的Sambrook等；Miller等，1986Genetic Engineering, 8:277-298 和其中引用的参考文献。在涉及将编码大分子的核酸序列和编码试剂的核酸序列插入的本发明第一方法中，可能需要采用含单独选择标记的质粒。通过利用第一质粒中的第一选择标记，转化/转染细胞可以培养或接种于含选择试剂的培养基中。在一个实施方式中，所述选择试剂是抗生素或抗真菌的。在另一个实施方式中，第二质粒包括第二选择标记。通过利用第二选择试剂，能选择含两种质粒的宿主细胞。最终结果是含两个DNA区段的宿主细胞:一个区段编码作为透膜剂的蛋白而第二区段编码生成所需的大分子。所述质粒载体还包括指导宿主细胞中所述试剂或大分子表达的调节序列。在本发明的一些实施方式中，所述质粒(或携带大分子或试剂的编码序列的其他载体)包括能在真核生物和/或原核生物中复制小基因(minigene)的序列以及这些系统的选择标记。这些包括常规控制元件，所述元件操作性连接编码所述试剂或大分子的序列，连接方式允许该序列在转化或转染有质粒载体的细胞中转录、翻译和/或表达。在一个实施方式中，第一质粒包括在调节序列操作性控制下编码透膜剂的核酸序列，所述调节序列指导宿主细胞中所述试剂的表达。本文所用的“操作性控制”指核酸序列以某一方式与表达控制或调节序列定位，使得所述调节序列指导感兴趣核酸序列的表达。调节序列可毗邻感兴趣核酸或调节序列可呈反式或有一定距离以控制感兴趣核酸。在另一个实施方式中，第一或第二质粒包括在含诱导型启动子的第二调节序列操作性控制下编码所述大分子的核酸序列，所述调节序列指导宿主细胞中所述大分子的表达。在另一个实施方式中，所述诱导型启动子是严格调节的启动子。调节序列包括合适转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效RNA加工信号如剪接和聚腺苷酸化(PolyA)信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak共有序列)；提高蛋白稳定性的序列；以及需要时增强编码产物分泌的序列。本领域已知且可利用许多表达控制序列，包括天然、组成型、诱导型和/或组织特异性的启动子。可用于本发明的调节序列包括能驱动感兴趣大分子序列表达和在共表达情况下驱动透膜剂表达的任何启动子。这包括但不限于:病毒启动子、细菌启动子、植物启动子、合成启动子、组成型启动子、组织特异性启动子、发育特异性启动子、诱导型启动子、宽松调节的启动子、严格调节的启动子和致病或疾病相关启动子。许多这类有用启动子可参见重组蛋白表达的常规教材或多种已知科学出版物。质粒载体的合适启动子和增强子、选择标记基因、复制起点、扩增子和其他常规组件的列表可参见出版物如上面引用的Samtoook等，这些出版物通过引用纳入本文。在本发明的某些实施方式中，第一质粒的启动子是“渗漏(leaky)”启动子，如缺乏诱导剂或条件时显示可变表达水平的诱导型启动子。在本发明的其他实施方式中，第一调节序列包含组成型启动子。在本发明的其他实施方式中，第一调节序列包含诱导型启动子。在本发明的另一个实施方式中，第二调节序列包含的启动子不同于第一调节序列的启动子。在一个实施方式中，第二调节序列包含的诱导型启动子不同于第一调节序列的启动子。在本发明的一些实施方式中，所述试剂低表达以防止不需要的细胞毒性或裂解。在一个实施方式中，第一质粒的启动子是组成型启动子，如引起基因在大部分细胞类型中于多数时间表达的启动子，从而转化有此质粒的宿主细胞连续生成质粒组分。例如，可用于表达大分子的质粒中的某些组成型启动子包括但不限于:逆转录劳斯肉瘤病毒(RSV) LTR启动子(可选有RSV增强子)、巨细胞病毒(CMV)启动子(可选有CMV增强子)[参见例如Boshart等，Cell, 41:521-530 (1985) ]、SV40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、P -肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、和EFl a启动子[英杰公司(Invitrogen)]。在本发明的某些实施方式中，第一或第二质粒或两者的启动子可以是诱导型或可调节的，如使细胞暴露于试剂、生 物分子、化学物、配体、光或一些其他刺激物或用之处理细胞后引起核酸序列表达。诱导型启动子和诱导型系统可由多种商业来源获得，包括但不限于:英杰公司、克隆泰克(Clontech)和阿瑞雅德(Ariad)。许多其他系统已有描述且能由本领域技术人员容易选择。这种诱导型启动子的非限制性列表包括PRl-a启动子、原核抑制子-操纵子系统和高等真核转录激活系统，如美国专利号7091038中所详述。这些启动子包括来自大肠杆菌的四环素(“Tet”)和乳糖(“Lac”)抑制子-操纵子系统。其他诱导型启动子包括玉米的干旱诱导型启动子；来自马铃薯的冷、干旱和高盐诱导型启动子，拟南芥的衰老诱导型启动子SAG12，以及LEC1、LEC2、FUS3、AtSERKl和AGLI5的胚胎发生相关启动子，所有这些都为本领域技术人员已知。其他诱导型启动子包括锌诱导型羊金属硫蛋白(MT)启动子和地塞米松(Dex)诱导型小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子。其他诱导型系统包括17聚合酶启动子系统[W098/10088];蜕皮激素昆虫启动子[No 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 93:3346-3351 (1996)]、四环素抑制型系统[Gossen 等,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:5547-5551 (1992)]、四环素诱导型系统[Gossen 等，Science, 268:1766-1769 (1995)，还参见 Harvey 等,Curr.0pin.Chem.Biol.，2:512-518(1998)]。其他系统包括FK506 二聚体，使用甘珀二醇(castradiol)、联苯酌 米乐留酮(diphenol murislerone)的 VP16 或 p65, RU486-诱导型系统[Wang 等，Nat.Biotech., 15:239-243 (1997)和 Wang 等，Gene Ther.，4:432-441 (1997)]和雷帕霉素诱导型系统[Magari 等，J.Clin.1nvest., 100:2865-2872(1997)]。其他启动子包括 rhaT 启动子(Giacalone等，BioTechniques, 40 (3): 355-63 (2006))。严格调节启动子是在缺乏诱导剂或条件时不允许任何可检测表达或能用第二试剂或条件抑制的诱导型启动子。在一个实施方式中，与编码大分子的核酸序列操作性连接的调节序列是严格调节启动子。在本发明的另一个实施方式中，将含选定核酸序列的载体或质粒通过任何合适方法递送给宿主细胞，包括本文所述的那些。用于构建本发明任何实施方式的方法为具备核酸操作技术的人所已知且包括遗传工程、重组工程和合成技术。参见例如Samtoook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manul (《分子克隆:实验室手册》)，纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press)。在一个实施方式中,将含编码大分子或试剂的核酸序列的质粒用金属阳离子如钙、铷或镁的氯盐转至宿主细胞。在另一个实施方式中，将含编码大分子或试剂的核酸序列的质粒用电穿孔转至宿主细胞。F.培养转染的宿主细胞本发明的一个优势在于其可缩放(scaleable)且能生成大量重组大分子。根据本方法，宿主细胞通过常规方式生长至高细胞密度然后用透膜剂外部处理或者诱导或活化胞内产生透膜剂。因此，通过调整宿主细胞的细胞密度来获得充足量的重组大分子。在本文所述方法的任一实施方式中，将含上述核酸序列或分子之一或两者的宿主细胞培养至足以满足所需大分子生成水平的需要细胞密度。在一个实施方式中，视作适于生成大分子的细胞密度对应OD5950.3-100。在一个实施方式中，视作适于生成大分子的细胞密度对应OD5950.3-3.0。在一个实施方式中，视作适于生成大分子的细胞密度对应0D59520-100。在一个实施方式中，视作适于生成大分子的细胞密度对应0D59550-100。在一个实施方式中，视作适于生成大分子的细胞密度对应0D59575-100。在一个实施方式中，OD595为0.3。在一个实施方式中，OD595为0.4。在一个实施方式中，OD595为0.5。在一个实施方式中，OD595为0.6。在一个实施方式中，OD595为0.7。在一个实施方式中，OD595为0.8。在一个实施方式中，OD595为0.9。在一个实施方式中，OD595为1.0。在一个实施方式中，OD595为2.0。在一个实施方式中，OD595为3.0。在一个实施方式中，OD595为4.0。在一个实施方式中，OD595为5.0。在一个实施方式中，OD595为6.0。在一个实施方式中，OD595为7.0。在一个实施方式中，OD595至少为20。在一个实施方式中，OD595为30。在一个实施方式中，OD595为40。在一个实施方式中，OD595为50。在一个实施方式中，OD595为60。在一个实施方式中，OD595为70。在一个实施方式中，OD595为80。在一个实施方式中，OD595为90。在一个实施方式中，OD595为100。在一些实施方式中，细胞在对数生长期中收获，以确保透化细胞膜时的最优代谢功能。在任何所述方法中，培养条件取决于所用宿主细胞类型且能由本领域技术人员容易确定。例如，在一个实施方式中，宿主细胞是大肠杆菌时，所述细胞在LB培养液中37°C最优生长。在一些实施方式中，可能需要在室温培养细胞。在一些实施方式中，所述细胞大规模生长，如在发酵器中。在另一个实施方式中，宿主细胞是人HEK293细胞时，所述细胞在达氏修正伊氏培养基(DMEM)中于37°C 5%C02下最优生长。孵育时间可由本领域技术人员容易确定。在一个实施方式中，所述细胞培 养过夜，如8-14小时。此培养步骤中，需要大分子不表达到可检测水平，所述优选在严格调节启动子控制下。此培养步骤使透化剂能在细胞膜附近积聚。例如，细菌宿主细胞中，此培养步骤使所述试剂能在周质空间中积聚。在这些方法的一个实施方式中，宿主细胞一旦培养到所需密度，可浓缩或收集细胞，然后在任何诱导环境条件和营养混合物存在下培养。收获细胞的技术为本领域熟知。简言之，在一个实施方式中，将转化细胞接种于含适当选择抗生素的琼脂板后，选择单一菌落并在合适培养基中生长过夜。然后将培养液倒入塑料离心瓶并以5，OOOrpm离心15分钟沉淀细胞。随后倒出上清。所述细胞随后以所需量重悬于培养基或缓冲液。在另一个实施方式中，将转化的哺乳动物细胞接种入合适大小的培养瓶。所述细胞在所需温度如37°C于合适培养基中生长并能达到所需融合水平。在贴壁细胞的情况中，随后吸出培养基且用或不用胰蛋白酶使细胞从培养瓶上脱离，并将细胞重悬于所需体积的培养基中。在悬浮细胞的情况中，离心含所述细胞的培养基，并将成团细胞重悬于合适体积的培养基或缓冲液中。G.引发透化活性的环境条件在本方法的一个实施方式中，处于所需密度的宿主细胞，或可选经离心并通过移除培养液来浓缩的宿主细胞，暴 露于诱导透膜剂破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜的环境条件。此破坏使得能通过膜转运小分子量化合物。透膜剂必须不裂解宿主细胞，而是使宿主细胞膜仅对尺寸有选择性，即膜仍是大分子如酶的屏障，但多种小分子量化合物能容易地进入宿主细胞。在透膜剂由细胞所含质粒编码的一个本方法实施方式中，环境条件改变以引发宿主细胞内已积聚试剂的透化活性。在宿主细胞仅载有控制所述大分子表达的质粒的另一个实施方式中，环境条件包括使宿主细胞接触外部应用的透化剂，可选有其他环境条件。根据本文所述的生成方法，引发透化剂透化活性的环境条件包括至少一种下列条件:改变PH，改变盐浓度，改变渗透压，改变温度，使宿主细胞暴露于光，使宿主细胞暴露于试剂、生物分子、化学物或配体。在本文所述方法的一个实施方式中，改变pH包括将pH降低至约4-6.5。在一个实施方式中，pH从培养步骤的中性pH降至较低pH。例如,在一个实施方式中,pH降低至约4。在另一个实施方式中，pH降低至约4.5。在另一个实施方式中，pH降低至约5.0。在另一个实施方式中，pH降低至约5.5。在另一个实施方式中，pH降低至约6.0。在另一个实施方式中，PH降低至约6.5。可选择4-6.5间的其他中间pH值作为此步骤中的环境条件。在本文所述方法的另一个实施方式中，造成环境条件的所述试剂、生物分子、化学物或配体包括但不限于:还原剂、氧化剂、酸、碱或盐。可用于本发明的还原剂的示例包括但不限于:NADH、乙醛、￠-巯基乙醇和二硫苏糖醇。可用于本发明的氧化剂的示例包括但不限于:NAD+、H202和Mn0_。可用于本发明的酸的示例包括但不限于:乙酸、盐酸、硫酸等。在另一个实施方式中，造成环境条件的所述试剂、生物分子、化学物或配体包括离液剂。可用于本发明的离液剂的示例包括但不限于:尿素、硫脲、盐酸胍和高氯酸锂。在另一个实施方式中，造成环境条件的所述试剂、生物分子、化学物或配体包括表面活性剂。可用于本发明的表面活性剂的示例包括但不限于:聚山梨醇酯、山梨糖醇酯、泊咯沙姆或十二烷基硫酸钠。在另一个实施方式中，如果透膜剂在宿主细胞内是在诱导型启动子的控制下，造成环境条件的所述试剂、生物分子、化学物或配体包括诱导第一调节序列诱导型启动子的试剂。诱导诱导型启动子的试剂特异于选定的启动子。诱导剂的选择在本领域技术内。可用于本发明的诱导剂包括但不限于:IPTG、醇、四环素、甾类、金属和其他化合物。在宿主细胞不表达透化剂的本方法实施方式中，环境条件还包括将宿主细胞暴露于透膜剂，如上述的那些。与上述所引起相同的其他环境条件或试剂可选接触宿主细胞，该接触可与透化剂接触时间相同或在应用透化剂后的短时间如5-30分钟内。在一些实施方式中，可能需要优化透膜剂的量、浓度或活性。透膜剂的有效性可通过检测膜功能来评价。在一个实施方式中，评价通过检测脯氨酸转运、膜电位或36Rb流出来实现。脯氨酸转运、膜电位或36Rb减少约95%表明膜被透化。透化水平的确定可包括评价大分子生成量，如实施例4所详述。H.营养混合物—旦细胞膜完整性通过执行上述方法而破坏，宿主细胞的正常代谢活性就受影响。随着宿主细胞膜的通透屏障受到透膜剂影响，宿主细胞内环境会与宿主细胞外环境平衡。如此，所述方法涉及向宿主细胞环境补充营养混合物以改变宿主细胞内部从而产生有助于生成特定感兴趣大分子的胞内环境。所述方法涉及通过调整细胞外环境来控制细胞内环境。所述混合物包括宿主细胞进行所需代谢反应以生成需要的大分子所必需的营养物。因此，在本文所述方法的所有实施方式中，一旦宿主细胞膜如上所述被透化，宿主细胞就在营养混合物存在下培养，所述混合物包含能经破坏的细胞膜转运的组分。这些组分包括诱导第二调节序列启动子的诱导剂和允许所述大分子在膜破坏的宿主细胞中表达的代谢必需品。在一个实施方式中，营养混合物包含完全限定培养基，明确选择各组分的浓度和特性。在另一个实施方式中，营养混合物包含补充有所需组分(如核苷酸)的标准培养基(如LB培养液 )。本领域技术人员能根据所需的特定条件了确定合适混合物。在一个实施方式中，营养混合物处于pH4-10间的特定pH且盐浓度为约10_500mM。在一些实施方式中，盐浓度为约50-150mM，包括其间的浓度值。在一些实施方式中，pH为约7.0-7.5，包括其间的pH值。用于本文所述方法的营养混合物包含一种或多种能经透化细胞膜转运的组分来为细胞提供表达所编码的大分子所需的组分和条件。在一个实施方式中，混合物的一种必要组分是诱导控制所述大分子表达的启动子的诱导剂(如诱导rhaT启动子的L-鼠李糖)。可加入表面活性剂以增加膜透性。其他组分包括但不限于:盐、化学能源如三磷酸腺苷(ATP)、稳定剂、氨基酸、核糖核苷酸、辅因子、脱氧核糖核苷酸和非天然氨基酸。生成所述大分子所需的其他小分子或环境因子包括但不限于:渗透物，包括三甲胺N-氧化物(TMAO)、二甲基巯基丙酸内盐、三甲基甘氨酸、肌氨酸；和氧化还原改变剂如氧化和还原型谷胱甘肽。本领域技术人员可容易地根据宿主细胞特性、大分子和其他培养条件为营养混合物选择其他小分子组分。在一些实施方式中，营养混合物中渗透物和/或稳定剂的浓度范围为0.1mM-lM。在其他实施方式中，营养混合物中渗透物和/或稳定剂的浓度范围为ImM-lM。在其他实施方式中，混合物中盐、化学能源如三磷酸腺苷(ATP)、稳定剂、氨基酸、核糖核苷酸、辅因子、脱氧核糖核苷酸和/或诱导剂的浓度范围为0.1nM-1mM0在其他实施方式中，这些组分浓度范围为InM-.5mM。在一个实施方式中，所述浓度为InM。
在一个实施方式中，一旦向透化宿主细胞提供营养混合物，细胞就在通常为20-40°C间的合适温度下培养或保持一段足够时间以使细胞能代谢大分子。在一个实施方式中，足够时间是过夜，或例如约8小时。其他合适时间段包括1-4小时、5-10小时、12-24小时或更长。根据这些方法，所述大分子因而在宿主细胞中表达。
任一方法的其他实施方式能采用常规步骤从宿主细胞中回收已表达的所述大分子。回收已表达大分子的技术为本领域熟知且包括凝胶电泳、离子交换色谱、大小排阻色谱、反相HPLC、亲和及免疫亲和色谱和金属螯合亲和色谱。参见例如Sambrook, MolecularCloning(《分子克隆》)，第 3 版(2001)和 Simpson 等(编)，Basic Methods in ProteinPurification and Analysis:A Laboratory Manual (《蛋白纯化和分析基本方法:实验室手册》)(2008)。关于多肽和蛋白，有很多“标记”表达蛋白以允许用多种技术方便纯化的表达系统。将亲和标签添加到蛋白使其能用亲和技术从粗生物来源中纯化。色谱标签用于改变蛋白的色谱特性从而在特定分离技术中提供不同分辨率。表位标签是短肽序列，其选用是因为高亲和性抗体可在许多不同物种中可靠地生成。这些通常源自病毒基因，这是其高免疫反应性的原因。这些标签对于蛋白质印迹和免疫沉淀实验特别有用，尽管它们还在抗体纯化上获得应用以能用亲和色谱纯化。可用于本发明的特异白蛋白标记系统包括但不限于:聚组氨酸标签(HIS)、|丐调蛋白结合蛋白(CBP)、CYD(共价但可分离NorpD肽)、Strep
I1、FLAG、HPC(蛋白C重链)肽标签、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)和麦芽糖结合蛋白(MBP)系统。表位标签包括V5标签、c-myc标签和HA标签。本领域技术人员能容易选择地合适的大分子回收方法。基于本文所述教授内容，本领域技术人员能容易地根据大分子和细胞透化剂的选择来调整所述方法所用全部试剂的浓度和量，以及调整时间和温度条件以达到最优生成所述大分子。根据宿主细胞、大分子和透化剂的选择，基于本发明的教导，本领域技术人员能用本领域知识优化培养条件，选择营养混合物组分，选择环境条件，所述方法所用组分的量和浓度和其他方法参数。例如，能用实施例4所述试验就任何选定系统容易地确定最优通透性。如上所示，本发明提供相对已知表达系统的多项优势。不同于传统无细胞表达系统，本申请所述方法不需要第二系统制备DNA模板(在所述大分子是蛋白或多肽时)，因为所述模板在宿主细胞生长期间复制。另外，本发明中生成大分子的能力在存储期间没有损失，因为长时间冷冻保存宿主细胞是已完善的技术。本发明的另一优势在于其可缩放且能生成大量重组大分子。宿主细胞系统能通过常规方法生长至高细胞密度然后用透膜剂处理。因此，能通过调节宿主细胞密度获得足够量的重组大分子。此外，由于细胞能在诱导大分子前浓缩，所用试剂量可大幅减少。本文所述方法在宿主细胞内产生有助于重组大分子获得其正确结构的条件。细胞内环境可通过调整细胞外环境来控制。随着宿主细胞膜的通透屏障受到透膜剂影响，宿主细胞内环境会与宿主细胞外环境平衡。因此，宿主细胞内部pH、渗透性、氧化还原电位或稳定剂浓度可通过改变宿主细胞外环境来调整。提供合适环境能原位生成有正确结构的大分子。II1.药物筛选方法本发明的另一优势在于其允许原位药物筛选。例如，可用上述生产方法在宿主细胞系统中生成适当修饰的重组蛋白的文库。如上面方法所述在宿主细胞内生成所述大分子之后，可用多种能穿过受损宿主细胞膜的小分子药物处理宿主细胞。在一个实施方式中，这些小药物是需要结合经修饰重组大分子如蛋白的那些。在筛选方法的其他实施方式中，其他小药物是设计成引发一些信号传导事件或所表达大分子的其它活性的那些。然后使用常规方法鉴定含结合有小药物的重组分子如蛋白的那些宿主细胞。其他常规方法是设计成测量大分子生成水平或其他活性等的那些。本文所用的术语“药物”可指药物或非药物化合物或底物，对其就与大分子生成或活性相关的一些特性进行评价。例如，感兴趣的大分子能是工业用酶(如木聚糖酶)或诊断用酶(如DNA聚合酶(PCR酶))。在此实施方式中，建立大肠杆菌中的变体库以搜索具有所需特性的变体。对于木聚糖酶，所述底物是多聚糖￠1,4-木聚糖。因此,在一个实施方式中，原位药物筛选方法包括在微孔板的各孔中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含(i)在第一调节序列操作性控制下编码透膜剂的第一核酸序列，所述第一调节序列指导宿主细胞中所述试剂的表达；和(ii)在含诱导型启动子的第二调节序列操作性控制下编码所述大分子的第二核酸序列，所述调节序列指导宿主细胞中所述大分子的表达。各孔内宿主细胞中的第二核酸序列编码不同的大分子。培养共转化宿主细胞至允许透膜剂积聚的选定细胞密度。然后，将各孔的宿主细胞暴露于适合诱导透膜剂破坏细胞膜完整性而不完全裂解所述膜的环境条件，从而能通过膜转运小分子量化合物。随后，在营养混合物存在下培养各孔的宿主细胞，所述营养混合物包含能通过已破坏细胞膜转运的组分，所述组分包含诱导各孔中细胞的第二调节序列启动子的诱导剂；和允许在各孔的膜破坏宿主细胞中表达所述大分子的代谢必需品，其中所述大分子在各孔的宿主细胞中表达。在一个实施方式中，在诱导第二启动子前用能经细胞膜转运的小分子量测试剂处理各孔。在另一个实施方式中，在诱导第二启动子后用能经细胞膜转运的小分子量测试剂处理各孔。在另一个实施方式中，各孔的宿主细胞可通过接触常规裂解剂而充分裂解然后用测试剂处理细胞。所述试剂的量可由本领域技术人员确定，但一般为约0.01微摩尔(0.01 PM)到ImM。添加测试剂的目的是评价其对所需大分子生成的影响或测定负责所述大分子和测试剂结合的特 定残基。例如，在一个实施方式中，测试剂结合所述大分子的某些变体而不结合其他。在另一个实施方式中，测试剂可就一种大分子变体引发培养中的信号事件而对其它变体则不然。此后，用常规试验测定响应(如通过结合)测试剂存在的大分子变体的特性，所用试验鉴定和/或定量各孔内所生成的大分子变体。在另一个实施方式中，原位测试方法涉及与上面类似的步骤，但各孔包含同样由的两种质粒共转染的相同宿主细胞，即各孔中表达同一大分子。如上所述，细胞通过接触环境条件而透化，并接触营养混合物。然而，在此实施方式中，各孔用不同测试剂，即来自测试化合物库的试剂处理。之后以和上述相同的方式使用常规试验测定哪种测试剂影响大分子生成或结合大分子。在另一个实施方式中，第二种生成方法可用于筛选试验。宿主细胞仅含具有编码大分子(或大分子变体)的核酸序列的单一质粒。细胞在多孔板的各孔中培养至所需密度，然后接触外部应用的透化剂和/或诱导透化事件的环境条件。随后，可在各孔内透化细胞接触上述营养混合物的同时、或之后某个时间应用测试剂库(或单一测试剂)。以上述方式，对各孔内容物进行常规试验会确定哪种试剂诱导单一大分子响应或哪种大分子变体响应单一测试剂。IV.实施例下列实施例显示本发明的组合物和方法的应用。实施例1.生成酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的方法A.为共表达透膜剂和大分子构建含两种核酸分子的宿主细胞由DNA序列编码为透膜剂，完整的白喉毒素(DT)基因在活性位点残基中含3碱基对突变(E148S)，产生称为DT-E148S的低毒、减弱形式DT的。此核酸序列用常规技术组装并描述于 O，Keefe 和 Collier, PNAS, 86:343-6(1989)。将此序列克隆入pFIKH-Flexi 质粒载体(普洛麦格(Promega))，诱导型17启动子之后。17启动子可用异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导，但在IPTG缺乏时显示基底表达水平(渗漏表达)。pFIKH-Flexi 载体包含能用于鉴定已成功转染大肠杆菌宿主的选择标记kar/ (卡那霉素抗性)。将含DT-E148S的“第一”质粒(pDT_E148S)转化至感受态大肠杆菌宿主细胞中并在含50 u g/ml卡那霉素的LB琼脂上划线培养且37°C生长过夜。选择单个菌落并在15mL含卡那霉素的LB培养液中37°C生长15小时。使细胞离心成团并用于下一步骤。“第二”质粒 pRHA 质粒如 Giacalone 等，2006, Biotechniques, 40 (3): 355-63 中所述构建。PRHA质粒包含能用于鉴定已成功转染大肠杆菌宿主的选择标记amp1"(氨节青霉素抗性)。将编码大分子蛋白aFGF的DNA序列克隆入pRHA质粒，rhaT启动子之后。所述蛋白可选标记有GST或组氨酸标签以从宿主细胞中后续纯化。rhaT启动子是严格调节的启动子，可通过添加L-鼠 李糖诱导且在D-葡萄糖存在时受到抑制。将含编码靶标大分子的核酸序列的这种“第二”质粒转化到含编码透膜剂DT-E148S的“第一”质粒的大肠杆菌中。共转化的大肠杆菌宿主细胞在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂上划线培养并37°C生长过夜以选择含两种质粒的细胞。选择单菌落并在15mL含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养液中37°C生长15小时。B.培养宿主细胞到选定密度大肠杆菌在LB培养液中培养，培养液补充有0.2%D-葡萄糖以抑制所述大分子表达，但允许DT-E148S表达。此时间中，大肠杆菌宿主细胞由于其渗漏启动子而表达DT-E148S且由于其前导序列而将其定位于细胞周质空间。宿主细胞达到OD595L 0的选定细胞密度时，收获大肠杆菌宿主细胞并倒出培养液，OD595L 0是一般选择成使大分子生产最大化的细胞密度。C.透化宿主细胞所述细胞随后暴露于诱导透化剂破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜的环境条件。此实验中，细胞重悬于酸性缓冲液(琥珀酸钠)以降低PH至约5.0，持续约5分钟。不希望受理论约束，酸性介质诱导周质DT-E148S分子的构象变化，使其能插入细胞膜并破坏膜完整性而不完全裂解宿主细胞。因此，细胞膜的这种破坏能经膜转运小分子量化合物，如约50-2000道尔顿的小分子。D.生成大分子发生透化后，酸性缓冲液交换为LB和营养混合物，所述营养混合物包括诱导rhaT启动子的L-鼠李糖以及透化细胞代谢和膜破坏细胞中生成蛋白aFGF所需的其他小分子化合物。这些分子的大小能经破坏的细胞膜转运。此情况中的所述组分包括ATP、氨基酸和核糖核苷酸。各组分添加至浓度约ImM。已诱导细胞在37°C保持过夜。使所述细胞离心成团并裂解且用常规色谱方法纯化大分子蛋白aFGF。实施例2:产生成纤维细胞生长因子20(FGF-20)的方法A.为表达大分子构建含核酸分子的宿主细胞如Giacalone 等，BioTechniques, 40 (3): 355-63 中所述构建的 pRHA 质粒包含能用于鉴定已成功转染大肠杆菌宿主的选择标记amf (氨苄青霉素抗性)。将编码大分子蛋白FGF-20的DNA序列克隆入pRHA质粒，rhaT启动子之后。所述蛋白可选标记有GST或组氨酸标签以从宿主细胞中后续纯化。rhaT启动子是严格调节的启动子，可通过添加L-鼠李糖诱导且在D-葡萄糖存在时受到抑制。将含编码靶标大分子的核酸序列的这种质粒转化到感受态大肠杆菌细胞中。已转化的大肠杆菌宿主细胞在含50 u g/ml氨苄青霉素的LB琼脂上划线培养并37°C生长过夜以选择含所述质粒的细胞。选择单菌落并在15mL含氨苄青霉素的LB培养液中37°C生长15小时。使细胞离心成团并用于下一步骤。B.培养宿主细胞到选定密度将大肠杆菌在LB培养液中培养，其中补充有0.2%D-葡萄糖以抑制所述大分子表达。宿主细胞达到OD595LO的选定细胞密度时，收获大肠杆菌宿主细胞并倒出培养液，OD595L 0是一般选择成使所述大分子生产最大化的细胞密度。C.透化宿主细胞所述细胞随后在足以破坏细胞膜完整性而不完全裂解细胞膜的环境条件下暴露于外部添加的透化剂大肠杆菌素Y。此实验中，收获的大肠杆菌随后重悬于中性缓冲液并用2 U g/ml的透化剂大肠杆菌素Y处理约5分钟。此处理破坏细胞膜完整性而不完全裂解宿主细胞。因此，细胞膜的这种破坏能经膜转运小分子量化合物，如约50-2000道尔顿的小分子。D.生成大分子发生透化后，中性缓冲液交换为LB和营养混合物，所述营养混合物中包括诱导rhaT启动子的L-鼠李糖以及透化细胞代谢和膜破坏细胞中生成蛋白FGF-20所需的其他小分子化合物。这些分子的大小能经破坏的细胞膜转运。此情况中的所述组分包括以约ImM浓度加入的ATP、氨基酸和核糖核苷酸。已诱导细胞在37°C保持过夜。使所述细胞离心成团并裂解且用常规色谱方法纯化大分子蛋白FGF-20。实施例3:原位药物筛选A.为共表达透膜剂和大分子构建含两种核酸分子的宿主细胞如实施例1所述将感受态大肠杆菌宿主细胞用质粒PDT-E148S转染。如实施例1所述获得蛋白5-a还原酶的变体并分别克隆入pRHA质粒，rhaT启动子之后，提供pRHA质粒库，库内差异仅在于所编码的蛋白5-a还原酶变体。将含蛋白变体编码序列的各质粒转化到含PDT-E148S的大肠杆菌细胞中。转化 细胞在含氨苄青霉素和卡那霉素的LB琼脂上划线培养并37°C生长过夜以选择含两种质粒的细胞。选择载有各变体的宿主细胞单菌落并在15mL含氨苄青霉素和卡那霉素的LB培养液中37°C生长15小时。B.培养宿主细胞到选定密度
变异大肠杆菌宿主细胞接种于96孔板，各板包含不同变体。孔内的各大肠杆菌在补充有0.2%D-葡萄糖的LB培养液中培养以抑制所述大分子变体表达，但允许积聚在宿主细胞周质中的DT-E148S表达。宿主细胞达到OD595LO的选定细胞密度时，收获大肠杆菌宿主细胞并倒出培养液。C.透化宿主细胞各孔的细胞重悬于酸性缓冲液(琥珀酸钠)以降低pH至约5.0，持续约5分钟。不希望受理论约束，酸性介质诱导周质DT-E148S分子的构象变化，使其能插入细胞膜并破坏膜完整性而不完全裂解宿主细胞。因此，细胞膜的这种破坏能经膜转运小分子量化合物，如约50-2000道尔顿的小分子。D.生成大分子发生透化后，各孔的酸性缓冲液交换为LB和营养混合物，所述营养混合物中包括诱导rhaT启动子的L-鼠李糖以及透化细胞代谢和膜破坏细胞中生成蛋白5_ a还原酶所需的其他小分子化合物。这些分子的大小能经破坏的细胞膜转运。此情况中的所述组分包括以约ImM浓度加入的ATP、氨基酸和核糖核苷酸。`还向各孔加入约0.01微摩尔-1mM测试剂，即也能经破坏的细胞膜转运的小分子量化合物，例如非那雄胺。已诱导细胞在37°C保持过夜。使所述细胞离心成团并裂解且用色谱标签纯化大分子蛋白5-a还原酶。如果测试剂能结合蛋白5-a还原酶变体，所述测试剂可通过质谱检测。质谱还用于鉴定结合变体。此药物筛选方法能使本领域技术人员能确定响应测试剂的变体大分子的特性。在此实验的另一个实施方式中，各孔中表达相同大分子，但各孔接触不同测试剂以鉴定哪种测试剂结合该大分子。实施例4:测定细胞通透性对于任何上述实施例，可在应用或表达细胞透化剂后采用方法来测试细胞膜通透性程度，以下已知且公开的过程是一种方法的示例。这些过程更详细描述于0’ Keefe和Collier, PNAS, 86:343-6(1989)等出版物。本领域技术人员可使用这些过程或类似过程优化本文所述方法。显微镜下观察所述细胞以确保细胞未裂解。A.膜电位转化的大肠杆菌细胞在L培养液中生长到OD595LO15离心细胞并重悬于2mMTris *HCl/50mM NaCl, pH7.0至3xl09/ml浓度。对于各实验点，细胞1:10稀释于含50mMNaCl的不同pH值的5mM缓冲液中。自此，细胞在温控、磁力搅拌小管中37°C保存。向单独小管加入下列缓冲液:Pipes (pH7.0和6.5)、Mes (pH6.0)和柠檬酸钠/琥珀酸钠(pH5.5和5.0)。细胞(含pH特定缓冲液)孵育I分钟，然后加至IOOmM Tris-HCl (pH7.5)。I分钟后，加入碘化-3，3’ 二丙基硫杂二羰花青(俄勒R州尤金的分子探针公司(MolecularProbes))至终浓度I y g/ml。信号稳定时测定的荧光除以pH7.0时的荧光以获得相对荧光。荧光在SLM AMINCO (伊利诺伊州乌尔班纳)SPF-500C荧光分光光度计中测量，激发为645nm且发射为668nm。2个狭缝都设为5nm。B.脯氨酸转运
细胞在无钾的M9培养基(磷酸钠取代磷酸钾)中生长过夜，用相同培养基1:100稀释。生长5小时后，细胞重悬于生长培养基至OD595L O。将0.1mL细胞加至含
4.8 u Ci (lCi=37GBq) L-[2, 3, 4, 5- ]脯氨酸的不同 pH 值(同上)的 1.9ml20mM 缓冲液中。37 0C 10分钟后，细胞经Millipore (密理博)HA滤器过滤并用5ml无钾的M9盐洗涤。干燥滤器并溶于OC