一种激活促红细胞生成素基因表达的方法【技术领域】[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种激活促红细胞生成素基因表达的方法。[0002]TALE (Transcription activator-effectors)技术是一种薪新的分子生物学工具。研究学者发现，来自植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)分泌的一种TALE蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有着恒定的对应关系。利用TALE的序列模块，可组装成特异结合任何DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的(LiT,Huang S, Jiang W Z,et al.TAL nucleases (TALNs): hybrid proteins composed of TALeffectors and FokI DNAcleavage domain.Nucleic Acids Res.2011;39(I):359-372.)。[0003]目前 TALE 技术主要有两种应用:l)TALEN(transcription activator-like (TAL)effector nucleases)的基因敲除；2) TALEA (transcription activator-like (TAL)effector activator)的转录激活。TALEA的转录激活是将识别特异DNA序列的TALE与转录激活区域VP64 (VP64Activation Domain)融合,可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA，将TALEA质粒转入细胞后，表达的融合蛋白结合启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与PolII结合，激活目标基因的转录，从而提高了内源目标基因的表达(Zhang F, Cong L, Lodato S, et al.Efficient construction ofsequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription.NatBiotechnol.2011; 29⑵:149-153.)。目前，TALEA已经成功运用到哺乳动物细胞中，Miller等利用人工设计的TALEA在人HEK293细胞中能够激活内源性NTF3基因的转录并使其表达水平增加了 20 倍(Miller JC, Tan S, Qiao G, et al.A TALE nuclease architecture forefficient genome editing.Nat Biotechnol.2011; 29 (2): 143-148.)。因为 TALE 技术无基因、细胞、物种限制，实验设计简单，毒性低、脱靶情况少等优点，TALE技术在酵母、动植物细胞的基因组定点修饰、遗传疾病的基因疗法及基因的功能研究等方面都有广阔的应用前旦o[0004]骨髓间充质干细胞(MSC)是骨髓中除造血干细胞以外的一类具有高度可塑性的细胞群体，是骨髓基质细胞的前体细胞。在特定的诱导条件下具有向骨、软骨、肌腱、心肌、神经、脂肪等基质细胞分化的能力(George J, Goldstein E, Abashidze A, etal.Erythropoietin promotes endothelial progenitor cell proliferative andadhesive properties in a PI3-kinase-dependent manner.Cardiovasc Res.2005 ；68(2):299-306.)。由于骨髓间充值干细胞具有采集方便、易于在体外培养、诱导和扩增以及免疫原性低等特性，被认为在细胞治疗、基因治疗、组织工程等领域具有广阔的应用前景。近年来的许多动物实验和临床研究均证明，以干细胞为基础的细胞移植在心血管疾病中的治疗效果显著。但目前研究发现，移植细胞在心肌微环境下发生凋亡可能是影响心功能改善效率的重要原因之一(Lange C，Schroeder J, Stute N，et al.High-potential humanmesenchymal stem cells.Stem Cells Dev.2005;14(I):70-80.)。[0005]促红细胞生成素(erythropoietin, EP0)是促进红细胞分化和生存的主要细胞因子，是细胞生长因子超家族成员之一。有实验表明，心血管组织可以表达EP0，表明EPO可能起到保护心肌细胞的作用，外源性EPO具有很好的治疗心血管疾病的作用(Van derMeer P, Lipsic E, Henning RH, et al.Erythropoietin improves left ventricularfunction and coronary flow in an experimental model of ischemia-reperfusioninjury.Eur J Heart Fail.2004; 6 (7): 853)。已有文献报道，EPO 治疗联合 MSC 较单独的MSC移植能进一步改善缺血下肢功能恢复和组织重塑，这可能与体内EPO增加，EPO能抑制MSC凋亡，促进MSC分泌VEGF以及EPO本身血管生成能力有关(Zhang D, ZhangF, Zhang Y, and et al.Erythropoietin enhances the angiogenic potency ofautologous bone marrow stromal cells in a rat model of myocardial infarction.Cardiology.2007; 108 (4): 228-36.)。然而传统的EPO注射易出现红细胞增多，多次注射有导致纯红细胞再生障碍等不良反应(Rossert J, Pure Red Cell Aplasia GlobalScientific Advisory Board (GSAB) ? Erythropoietin-1nduced, antibody-mediated purered cell aplasia.Eur J Clin Invest.2005;35:95-99.)。

[0006]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用TALE技术在人自体骨髓间充质干细胞(MSC)中激活EPO (促红细胞生成素)基因表达的方法。本发明选用人EPO基因和人骨髓间充质干细胞作为靶基因和靶细胞，利用TALE技术在MSC细胞中激活EPO基因的表达，为基因治疗提供新了一种新的细胞来源，并将在组织工程和细胞治疗中发挥重要作用。
[0007]本发明首先公开了一种激活促红细胞生成素基因表达的方法，为利用TALE技术在目的细胞中激活促红细胞生成素(EPO)基因的表达，包括以下步骤:
[0008]I)在促红细胞生成素(EPO)基因启动子上游寻找TALE靶点序列，设计特异性识别TALE靶点序列的由TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块；
[0009]2)靶点识别模块编码序列的构建:构建编码步骤I)所述靶点识别模块的双链DNA ；
[0010]3)通过酶切连接的方法，将步骤2)制备的所述靶点识别模块编码序列与骨架载体连接，获得重组质粒；
[0011]4)重组质粒转染目的细胞，及目的细胞的培养。
[0012]较优的，步骤I)所述TALE靶点序列为EPO (促红细胞生成素)基因启动子上游16~20个连续的碱基。
[0013]更优的，步骤I)所述TALE靶点序列为EPO基因启动子上游18个连续的碱基。
[0014]最优的，步骤I)所述TALE靶点序列如SEQ ID NO:2所示。
[0015]较优的，步骤I)所述靶点识别模块的TAL核酸识别单元组成为N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI。
[0016]更进一步的，步骤I)所述靶点识别模块的氨基酸组成如SEQ ID NO:21所示。
[0017]靶点识别模块N1-HD-HD-HD-HD-NG-NN-NN-HD-NN-N1-HD-HD-HD-HD-NG-ND-NI 的氨基酸序列组成如SEQ ID N0:21所示。[0018]本发明的靶点识别模块由N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元组成。所述TAL核酸识别单元为重复的34个恒定氨基酸序列，其中12、13位点双连氨基酸与A、T、G、C四种碱基有恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，NN识别G，HD识别C。因此，本发明靶点识别模块中的N1、NG、NN、HD不指代具体的氨基酸，而是代表特异性识别A、T、G、C四种碱基的TAL核酸识别单元；根据TALE靶点序列的碱基组成，获得由对应TAL核酸识别单元组成的靶点识别模块。
[0019]通过TALE技术，能够组装成特异结合任意DNA序列的模块蛋白(靶点识别模块)，从而达到靶向操作内源性基因的目的。
[0020]N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元各自对应一个能够编码该识别单元的单体，所述单体为双链DNA。对照靶点识别模块的组成，对编码不同TAL核酸识别单元的单体进行串联组装，即可获得能够编码该靶点识别模块的双链DNA (靶点识别模块编码序列)。所述串联组装方式可以为在首尾相邻的单体之间设有相同的粘性末端，具体可通过在单体序列内TAL核酸识别单元编码序列两侧插入对应的酶切位点，通过多步酶切、连接的方法获得，或采用同序异尾限制性内切酶一步酶切法获得。
[0021]较优的，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
[0022]A.构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；
[0023]B.按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，通过酶切、连接的方法获得靶点识别模块编码序列。
[0024]本发明的连接末端是位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的双链DNA序列，连接末端含有酶切位点序列(包括限制性内切酶识别序列和/或限制性内切酶剪切序列)，可以经限制性内切酶酶切获得特定的粘性末端。当某一单体下游的连接序列与另一单体的上游连接序列酶切后获得互补粘性末端的时候，该两个单体能够连接并且连接顺序是一定的，因此可以通过特定连接末端序列的设计，将多个单体按照特定顺序进行连接。
[0025]更优的，步骤2)所述靶点识别模块编码序列的构建步骤具体如下:
[0026]a按照所述靶点识别模块的组成，将靶点识别模块由N端开始向C端方向，顺次按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式分组，构成r.V/.__""!个次模块；
[0027]b构建单体库:所述单体库包括分别针对N1、NG、NN、HD四种TAL核酸识别单元的四个次库，每一个次库包括彼此分离设置的M个单体，并且M个单体按照第I位至第M位的顺序顺次排列，所述单体为双链DNA，其序列包括该单体所属次库针对的TAL核酸识别单元的编码序列以及位于TAL核酸识别单元编码序列左右两侧的酶切后粘性末端不同的连接序列，并且按照单体的排序，前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补；每一次库中的M个单体从排序第I的单体开始，顺次以每n个单体作为一个分组，共获得个分组，并且同一分组内前一单体下游连接序列酶切后的粘性末端与后一单体上游连接序列酶切后的粘性末端互补，但与该分组内其他单体连接序列酶切后的粘性末端是非互补的；四个次库之间，排次相同的编码不同TAL核酸识别单元的四种单体，其上游连接序列酶切后的粘性末端彼此相同，下游连接序列酶切后的粘性末端也彼此相同；
[0028]c按照所述靶点识别模块的组成，由N端开始向C端方向，从前述单体库中依次选择对应的单体，按照每n个单体一组的方式连接，构成LM/?」个编码对应次模块的n联单体，然后再将IMMj个n联单体连接，或者将LM/?j个n联单体与该靶点识别模块组成所需要的其他单体连接，获得靶点识别模块编码序列；其中，M为靶点识别模块中TAL核酸识别单元的数目，n为整数，并且n的取值范围为2~6。
[0029]本发明中H为向上取整的符号，所述『M?l为取比[M/n]大的最小整数。Li为向下取整的符号，所述为取比L.M/W小的最大整数。
[0030]本发明步骤a是指:由于靶点识别模块由M个TAL核酸识别单元组成，因此从靶点识别模块N端的第一个TAL核酸识别单元开始向靶点识别模块的C端，按照每n个TAL核酸识别单元一组的方式，依次将靶点识别模块分为个次模块，『I为向上取整的符号，当M/n能够整除时，所述靶点识别模块分为I"M/?l个次模块，并且每个次模块内含有n个TAL核酸识别单元；当M/n不能整除时，所述靶点识别模块分为『M/h1个次模块，前『Mwl-1个次模块的每个次模块内含有n个TAL核酸识别单元，余下的第个次模块内包括