一种制备成熟红细胞的方法[0002]在过去的一个世纪中，同种异体输血已经成为治疗严重缺血患者(例如，急性贫血、严重的血小板减少症、血友病)的救命手段，但是，同种异体输血导致疾病传播(例如，肝炎、AIDS、梅毒、疟疾以及其他血源性疾病)的风险依然存在。今天，在北美、西欧等发达国家以及某些发展中国家，同种异体输血一般都是安全的，这是因为现在已经使用了高敏感性的检测方法如核酸扩增技术来筛查AIDS和其他感染性疾病。在美国，单次输血感染HIV的风险大约为1/1，000, 000(McCullough, J.在无病原血液供应方面取得的进步(Progresstoward a pathogen-free blood supply)。Clinical Infec.Dis.2003;37:88 - 95)? 但是，通过输血发生感染的风险依然是存在的，因为微生物感染都有一个窗口期，在这个时期内，检测结果是阴性的。对于那些新出现的病原体来说(例如，各种克雅病、西尼罗河病毒、A5N1和其他禽流感病毒)，目前还未纳入检测范围。在第三世界国家，血源性传播疾病普遍流行，这是由于供者血液筛选不严格、存在卖血现象以及依赖家庭供者献血等造成的。在2008年，全球共采集了 93，000, 000个单位的血液，其中约有50%的血液是由发展中国家采集的，但是有42个国家无法对所有的血液进行四种输血感染微生物(HIV、乙型肝炎、丙型肝炎和梅毒)中的一种或多种的筛查，在发展中国家，只有47%的血液是在标准质控条件下进行检测的(World Health Organization.(2010).全球血液安全性与可用性一关键事实和数据(Global blood safety and availability—key facts and figures), 2010)。[0003]除了疾病传播的风险以外，同种异体供者血液在世界范围内都处于短缺状态，并且这种短缺将长期存在。由于我国人口老龄化问题越来越突出，适于献血的人群所占比例也在不断下降，导致血源供应紧张。另外，供者红细胞只能储存约5周的时间，在有大量伤员(如自然灾害，战争)需要输血的情`况下，供应短缺的问题将更加紧迫。再者，同种异体输血需要供者和受体具有相匹配的抗原/抗体状态，这也会导致血液供应出现结构性短缺。[0004]因此，目前输血医学依然面临着很多问题，其中就包括血液供需矛盾突出、输血感染依然存在、临床输血反应时有发生以及稀有血型患者难以及时得到合适的血液等。这也使得从事输血医学研究的人一直在思考和研究如何能够获得更安全、更加标准化的血液制品，其中利用干细胞体外培养生产成熟的有功能的红细胞就是大家一直努力的目标，这些红细胞可被称为体外培养的红细胞(cultured red blood cells, cRBC)。[0005]从目前的研究现状来看，体外培养扩增红细胞主要利用的是造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCsX[0006]在体外利用造血干细胞生产成熟红细胞的方法大致包括如下步骤:首先利用细胞因子如ΕΡ0、SCF、IL-3等刺激造血干细胞的扩增并诱导其向红系分化，然后单独用EPO刺激使其进一步扩增，最后通过基质细胞的支持使细胞去核形成成熟的红细胞。利用这种方法已经成功地培养出了成熟的有功能的红细胞，其中比较成功的例子是利用造血干细胞(脐血、外周或骨髓来源的⑶34+细胞)通过添加EPO、SCF、IL-3、羟皮质激素的无血清培养和基质细胞(小鼠骨髓基质细胞或人间充质干细胞)支持培养来获得红细胞，利用这种方法可以使脐血来源的造血干细胞扩增(2-6) X IO6倍，并且所获得的细胞中90%以上的都是去核的成熟红细胞，这些细胞具有正常的变形能力和功能正常的血红蛋白(GiarratanaMC, Kobari L, Lapillonne H等人,利用造血干细胞体外制备完全成熟的人红细胞(Ex vivogeneration of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells)Nat.Biotechnol,2005, 23(I):69_74)。[0007]但是用基质细胞支持培养显然难以在体外大规模生产红细胞，以达到临床应用的水平，因此建立完全悬浮的液体培养体系来扩增成熟的红细胞是按照GMP标准生产红细胞的必然要求。Miharada等建立了一种四步液体培养方法从脐血⑶34+细胞中扩增成熟红细胞，在这四个步骤中分别添加不同的细胞因子，但是不用任何滋养层细胞，结果使细胞的总扩增倍数达到6X105，其中GPA+细胞(代表晚幼红细胞和成熟红细胞)占93.6 %,去核的红细胞占50.0% (Miharada K, Hiroyama T, SudoK等，造血干祖细胞经过体外分化形成的幼红细胞的有效脱核(Efficient enucleation oferythroblasts differentiated in vitro from hematopoietic stem and progenitorcells), Nat Biotechnol, 2006，24:1255-1256)。另外一个试验小组利用 SCF、ΕΡ0、IGF-1和类固醇激素刺激，也从外周动员(G-CSF刺激从外周血中分离)的CD34+细胞中扩增出了去核的红细胞，但是这种方法只能使细胞扩增几十倍，并且其中去核的红细胞只占细胞总数的 48.8% (Dorn I, Lazar-Karsten P, Boie S，Ribbat J 等，利用两种不同的细胞培养体系将外周血来源的人CD34+细胞在体外增殖和分化成成熟红细胞(Invitro proliferation and differentiation of human CD34+cells from peripheralblood into muture red blood cells with two different cell culture systems),Transfusion, 2008,48:1122-1132.)。从这些结果来看，目前所建立的液体培养体系无论是从细胞扩增倍数还是成熟红细胞所占比例都还无法达到支持培养体系的扩增效果。[0008]到目前为止，人们利用了多种干细胞或祖细胞进行体外培养，试图能够大规模地生产红细胞，其中包括脐血、骨髓来源的和外周动员的CD34+细胞以及人胚胎干细胞，但是人们较少关注外周血来源的造血干/祖细胞，因为人们认为外周血来源的造血干/祖细胞增殖能力较弱，并且其中所含的⑶34+细胞比例较低。然而，Boehm D等人研究发现，外周血来源的CD34+细胞在无基质细胞支持的培养体系中可以扩增1.5X IO6倍，与脐血来源的CD34+细胞所达到的扩增效果相似。这说明外周血来源的CD34+细胞的增殖能力也是很强的(Boehm D，Murphy WG和Al-Rubeai M，人外周血来源的CD34+细胞用于体外生产红细胞的潜倉泛(The potential of human peripheral blood derived CD34+cells for ex vivored blood cell production),J Biotechnol.2009;144(2):127-134)。
[0009]由于外周血单个核细胞中⑶34+细胞的含量确实很低，约为0.1%，并且从中分离CD34+细胞作为生产红细胞的起始材料，不仅费事费力，而且会额外增加许多成本，因此亟需一种原材料来源丰富且制备方法简便的红细胞生产方法。

[0010]发明人通过大量的实验摸索，终于找到一种利用单个核细胞作为起始材料直接制备红细胞的方法，这样既可以利用血液处理时剩余的部分作为原材料，又可以省去分离⑶34+细胞的步骤。本发明基于以上发现而完成。
[0011]本发明第一方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，所述方法包括利用单个核细胞经过体外培养制备成熟红细胞的步骤。
[0012]根据本发明第一方面的方法，其中所述单个核细胞来自脐血或外周血；可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到单个核细胞，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到单个核细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。
[0013]在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。
[0014]在本发明的实施方案中，所述单个核细胞经过红细胞分化培养基和红细胞脱核培养基的培养得到成熟红细胞。
[0015]本发明第二方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤:
[0016]a)取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；
[0017]b)将步骤a)得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素，培养8-11天；优选地，每3-5天(例如4天)将细胞转移到新鲜的上述培养基中继续培养；
`[0018]c)收集步骤b)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3-5天；
[0019]d)收集步骤c)中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞；优选地，每3-5天(例如4天)将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养。
[0020]根据本发明第二方面的方法，其中步骤a)中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。
[0021]在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。根据本发明第二方面的方法，其中所述细胞因子的使用浓度为干细胞因子20-200ng/ml、白细胞介素3为5_20ng/mL和/或红细胞生成素2-lOIU/mL。
[0022]根据本发明第二方面的方法，其中羟皮质激素的使用浓度为细胞诱导培养时的常用浓度，在本发明的一个实施方案中，羟皮质激素的使用浓度为10_6m。
[0023]在本发明的实施方案中，所述干细胞因子的浓度为50_200ng/ml，例如为50、100、200ng/ml ;所述白细胞介素3的浓度为5_20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml ;所述红细胞生成素的浓度为3-10IU/mL，例如为3、5、10IU/mL。
[0024]本发明第三方面涉及一种制备成熟红细胞的方法，其包括以下步骤:
[0025]a)取脐血或外周血，分离得到单个核细胞；
[0026]b)将步骤a)得到的单个核细胞接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，培养5~9天(例如7天)；优选地，每3-5天(例如4天)将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养；
[0027]c)收集步骤b)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子1，继续培养5~9天(例如7天)；优选地，每2-3天将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养，使细胞浓度保持在I X 106/ml以下；
[0028]d)收集步骤c)中的细胞，接种到红细胞分化培养基中，添加红细胞生成素，继续培养3~5天；
[0029]e)收集步骤d)中的细胞，用红细胞脱核培养基继续培养7-10天，即得到成熟红细胞；优选地，每3-5天(例如4天)将细胞转移到新鲜的培养基中继续培养。
[0030]根据本发明第三方面的方法，其中步骤a)中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。
[0031]在本发明的实施方案中，其中所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。
[0032]根据本发明第三方面的方法，其中所述细胞因子的使用浓度为干细胞因子20-200ng/ml、白细胞介素3为5_20ng/mL和/或红细胞生成素2-lOIU/mL。在本发明的实施方案中，所述干细胞因子的浓度为50-200ng/ml，例如为50、100、200ng/ml ;所述白细胞介素3的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml ;所述红细胞生成素的浓度为3-10IU/mL，例如为 3、5、10IU/mL。
[0033]根据本发明第三方面的方法，其中步骤b)所述细胞因子的使用浓度为:2_20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白细胞介素11和/或20-100ng/mL Flt3配基。在本发明的实施方案中，所述骨形成蛋白4的浓度为5-20ng/ml,例如为5、10、20ng/ml ;所述白细胞介素11的浓度为5-20ng/mL，例如为5、10、20ng/ml ;所述Flt3配基的浓度为20_100ng/ml，例如为 20、40、100ng/ml。
[0034]根据本发明第三方面的方法，其中步骤c)所述细胞因子的使用浓度为:5_20ng/mL骨形成蛋白4、5-20ng/mL白细胞介素11和/或20_200ng/mL胰岛素样生长因子I。在本发明的实施方案中，所述骨形成蛋白4的浓度为5-20ng/ml,例如为5、10、20ng/ml ;所述白细胞介素11的浓度为5-20ng/mL,例如为5、10、20ng/ml ;所述胰岛素样生长因子I的浓度为 20-200ng/mL，例如为 20、40、100、200ng/ml。
[0035]根据本发明第三方面的方法，其中羟皮质激素的使用浓度为细胞诱导培养时的常用浓度，在本发明的一个实施方案中，羟皮质激素的使用浓度为10_6m。
[0036]本发明第四方面涉及根据本发明第一至第三方面任一项所述方法制备得到的成熟红细胞。
[0037]在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的平均细胞体积(MCV)为108~123fl ；在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的平均血红蛋白含量(MCH)为31~37pg ;在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的最大变形指数(DImax)为0.42~0.48 ;在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的葡萄糖6磷酸脱氢酶的含量为31~36U/g Hb ;在本发明的实施方案中，所述成熟红细胞的丙酮酸激酶含量为69~80U/gHb。
[0038]本发明第五方面涉及血液中的单个核细胞在制备成熟红细胞中的用途。
[0039]根据本发明第五方面的用途，其中的单个核细胞可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。
[0040]在本发明的实施方案中，所述单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离提到的。
[0041]本发明第六方面涉及细胞因子组合物，其包含羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素；优选地，其还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基，或者优选地，其还包含骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子I。
[0042]在本发明的一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3和红细胞生成素组成；在本发明的另一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和FMS样酪氨酸激酶3配基组成；在本发明的另一个实施方案中，所述细胞因子组合物由羟皮质激素、干细胞因子、白细胞介素3、红细胞生成素、骨形成蛋白4、白细胞介素11和胰岛素样生长因子I组成。
[0043]本发明还涉及本发明第六方面任一项的细胞因子组合物在由单个核细胞制备成熟红细胞中的用途。
[0044]以下对本发明做进一步描述。
[0045]术语“单个核细胞”在本文中是指血液中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞，也包括造血干细胞和祖细胞。可以用本领域常用的方法制备单个核细胞，例如，可通过红细胞裂解液(由790mg/L的碳酸氢`铵和7.7g/L的氯化铵混合而成)裂解红细胞以分离单个核细胞。在本发明中，单个核细胞是根据血液中细胞的密度不同分离得到的。其可以利用脐血或外周血的全血直接分离得到，也可以从脐血或外周血中分离出白膜层后再从白膜层制备得到。在本发明的一个实施方案中，所述单个核细胞来自脐血全血；在本发明的另一个实施方案中，所述单个核细胞来自外周血的白膜层。通过分离白膜层，可分离出浓缩红细胞和血衆以用于成分输血。
[0046]在本发明的实施方案中，分离方法是Ficoll-hypaque (葡聚糖一泛影葡胺)密度梯度离心法，因为血液中各有形成分的比重存在差异，因此得以分离。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状(buffy coat)，吸取该层细胞递经洗涤离心重悬可获得单个核细胞。在本发明的实施方案中，取外周血白膜层细胞或脐血全血用磷酸盐缓冲液稀释，然后用淋巴细胞分离液分离，吸取单个核细胞，用磷酸盐缓冲液洗涤细胞，即得到单个核细胞。
[0047]术语“造血干细胞”是指造血干细胞是指骨髓中的干细胞，具有自我更新能力并能分化为各种血细胞前体细胞，最终生成各种血细胞成分，包括红细胞、白细胞和血小板，它们也可以分化成各种其他细胞。造血干细胞有两个重要特征:其一，高度的自我更新或自我复制能力；其二，可分化成所有类型的血细胞。[0048]术语“祖细胞”是指在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，也称为造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells, HPCs),它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞(committed stem cell)。例如包括红细胞系造血祖细胞、中性粒细胞-巨噬细胞系造血祖细胞或巨核细胞系造血祖细胞。
[0049]术语“白膜层”在本文中是指抗凝血经过自然沉降、离心或密度梯度离心后形成的一个组分，主要由白细胞和血小板组成。抗凝血经过离心以后会形成上层的血浆、下层的红细胞以及二者之间薄薄的一层白色膜状物，约占血液总体积的1%，被称为白膜层。
[0050]术语“脐血”在本文中是指胎儿出生后留在胎盘和脐带中的血液，其中富含造血干细胞和祖细胞。
[0051]术语“成熟红细胞”在本文中是指血液中数量最多的一种血细胞，同时也是脊椎动物体内通过血液运送氧气的最主要的媒介，同时还具有免疫功能。成熟的红细胞是无核的，这意味着它们失去了 DNA。红细胞也没有线粒体，它们通过葡萄糖合成能量。
[0052]术语“干细胞因子”在本文中是指原癌基因c-kit表达产物的配体，主要由骨髓基质细胞产生，体内存在分泌型和跨膜型两种形式。有活性的干细胞因子为同源二聚体，可刺激干细胞分化为不同谱系血细胞，并刺激肥大细胞增殖。
[0053]术语“白细胞介素3”在本文中是指由活化的⑶4+T细胞产生的一种细胞因子，其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类型的血细胞。
[0054]术语“红细胞生成素”在本文中是指由骨髓中红细胞前体细胞分泌的一种细胞因子。在人体环境中，它由肝脏和肾产生，是调节红细胞生成数量的最重要细胞因子，它可以阻止红系祖细胞凋亡并诱导其进行有丝分裂，因此可以加速红系祖细胞的增殖，大大提高红细胞的生成数量。
[0055]术语“淋巴细胞分离液”可为本领域公知的淋巴细胞分离液，例如可以是HIST0PAQUE-1077 (Sigma公司)。在本领域中，淋巴细胞分离液的成分是一致的，如在本发明的实施方案中是指由葡聚糖和泛影葡胺组成的混合物，是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，其密度为1.13。
[0056]术语“红细胞分化培养基”是指有利于造血干细胞和祖细胞的增殖和向红细胞分化的培养基，其可按照本领域的常规配方和方法制备。在本文中是指由无血清培养基、胎牛血清和各种小分子组成的用于培养红细胞的一种培养基。其中无血清培养基为适合造血细胞培养的无血清培养基，例如可以为StemSpan SFEMCStemcell Technologies Inc.)、LONZAX-VIVO 15 (Lonza)或 8--η?Ρ Ο:^)-34 SFM (Life Technologies)。其中的小分子例如可包括生育酚、亚油酸、胆固醇、离子饱和的人转铁蛋白、重组人胰岛素、乙醇胺、二巯基乙醇、肝素钠、柠檬酸亚铁、维生素C、谷氨酰胺，在本发明的实施方案中，所述小分子包括生育酚、亚油酸、胆固醇、离子饱和的人转铁蛋白、重组人胰岛素、乙醇胺、二巯基乙醇。
[0057]术语“红细胞脱核培养基”是指有利于晚期幼红细胞向成熟红细胞分化并完成脱核过程的培养基，其可按照本领域的常规配方和方法制备。在本文中是指由IMDM、胎牛血清和各种小分子组成的用于培养红细胞的一种培养基。其中的MDM可用本领域其它常用培养基替代，例如alpha-MEM或DMEM，其中的小分子例如可包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氢二钠、米非司酮、硫代甘油、Pluronic F68 (Sigma公司)、肝素钠,在本发明的实施方案中,所述小分子包括腺苷、D-甘露糖、磷酸氢二钠和米非司酮。
[0058]在本发明中，“浓度”或“使用浓度”通常是指该细胞因子的终浓度。
[0059]在本发明中，各阶段细胞培养的密度通常应维持在IXlO6Ail以下，以保证细胞的正常生长。
[0060]在本发明中，制备得到的成熟红细胞可进行形态、结构和功能鉴定，例如包括细胞离心涂片染色，荧光抗体染色流式细胞仪分析、血红蛋白含量测定、葡萄糖6磷酸脱氢酶和丙酮酸激酶含量测定等。
[0061]发明的有益效果
[0062]本发明直接利用血液中的单个核细胞制备得到成熟红细胞，该方法具有以下优点:1)可利用血液处理后的剩余部分作为单个核细胞的来源，充分利用了废弃物；2)省去了纯化CD34+细胞的步骤，不仅可以节约成本，而且可以避免因纯化而导致的CD34+细胞丢失；3)红细胞的得率较高，按照初始单个核细胞数计算，得到的成熟红细胞数增加约1000倍左右，由于外周血单个核细胞中CD34+细胞的含量很低(约0.1%)，因此相当于扩增倍数达到了 IO60



[0063]图1为外周血单个核细胞生产红细胞的细胞生长曲线；
[0064]图2为外周血单个核细胞体外扩增过程中的活细胞形态(400 X )；
[0065]图3为不同培养天数时细胞的形态学特征和去核过程(1000X Wrights-Giemsa染色)；
[0066]图4为红系细胞的不同发育阶段(Pro-E:原幼红细胞；Baso-E:嗜碱性幼红细胞；Poly-E:多染幼红细胞；0rtho_E:正染幼红细胞；Enucleated:去核红细胞)；
[0067]图5为不同天数的培养物中处于各个发育阶段的红系细胞所占的比例；
[0068]图6为FACS分析细胞的分化及去核过程；其中A为不同培养天数的细胞中红系细胞的比例变化(ant1-glycophorin A抗体阳性)；B为细胞去核阶段去核细胞的比例变化(ant1-glycophorin A 抗体阳性且 Syto dye 16 阴性);
[0069]图7为细胞培养过程中集落形成细胞所占比例的变化；
[0070]图8为外周血单个核细胞增殖分化过程中的红系祖细胞增殖曲线。

[0071]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0072]实施例1:红细胞分化培养基的配制
[0073]配制IOOmL红细胞分化培养基需要如下成分:
[0074]