一种融合蛋白及其疫苗组合物的制备与应用的制作方法 【技术领域】，具体涉及一种猪肺炎支原体融合蛋白及含该 融合蛋白的疫苗组合物的制备与应用。 [0002] 猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS)又称猪气喘病（李彦明， 张映.猪肺炎支原体生物学研究进展，动物医学进展，2003, 24 (3) :25-27)或猪地方性流 行性肺炎，是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)所引起的一种猪接触性慢 性呼吸道疾病，分布十分广泛，以慢性、接触性、高度传染性、高发病率以及低死亡率等为特 点，主要表现为咳嗽和呼吸困难，解剖可见肺组织呈肉变或大理石样病变。 [0003] 衣阿华大学Ross研究发现：Mhp感染后淋巴细胞产生抗体的能力下降，细胞免 疫力下降，肺泡巨噬细胞对病原的吞噬和清除能力亦下降，抑制性T细胞的活动增强，导 致呼吸道免疫力减弱，抗病力下降，从而使其他病原体更容易侵入，可继发感染猪繁殖与 呼吸综合征、猪圆环等，从而导致多种疫苗接种失败。Mhp可经空气传播，易与其他细菌 性疾病如猪肺疫、传染性胸膜肺炎等并发（王茂文，猪肺炎支原体病的特点及其防制措 施?畜禽业，2008 (2) : 16-17 ;Dee S, Otake S, Oliveira S, et al. Evidence of long distance airborne transport of porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae. Veterinary research, 2009, 40(4) :39)，对养猪业造成重大的 经济损失，是当前最常发生、最广流行、最难净化的重要疫病之一。 [0004] 猪支原体肺炎亚单位疫苗不含全菌疫苗的核酸，不仅不存在灭活不彻底造成 的安全隐患，而且由于其不含全菌的所有抗原，有利于疾病的净化。但目前猪支原体肺 炎亚单位疫苗免疫效果不佳，不能给猪提供完全的保护（Fagan PK, Djordievic SP. Chin J, et al. Oral immunization of mice with attenuated Salmonella typhimurium aroA expressing a recombinant Mycoplasma hyopeumoniae antigen (NrdF). Infection and immunity, 1997, 65:2502-2507) 〇


[0005] 为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种融合蛋白，以及含该融合蛋白的疫 苗组合物与应用。该疫苗组合物既能产生细胞免疫，又能产生体液免疫，能获得较好的免疫 保护。
[0006] 本发明的主要目的在于提供一种融合蛋白，所述融合蛋白包含：
[0007] (1)假单胞杆菌外毒素 A结构域I，
[0008] (2)假单胞杆菌外毒素 A结构域II，
[0009] (3)猪肺炎支原体抗原性蛋白，以及
[0010] (4)羧基末端部分。
[0011] 其中，所述猪肺炎支原体抗原性蛋白位于假单胞菌外毒素 A结构域II与羧基末端 部分之间，且假单胞杆菌外毒素 A结构域II位于假单胞杆菌外毒素 A结构域I与所述猪肺 炎支原体抗原性蛋白之间。
[0012] 本发明所用术语"假单胞杆菌外毒素 A结构域I"是指与假单胞杆菌外毒素 A (Pseudomonas exotoxin A，简称为PEA)的氨基末端细胞受体结构域具有相同序列或具有 功能相当片段的肽片段。
[0013] 本发明所用术语"假单胞杆菌外毒素 A结构域II"是指与假单胞杆菌外毒素 A的 中间易位结构域具有相同序列或具有功能相当片段的肽片段。
[0014] 本发明所用术语"猪肺炎支原体抗原性蛋白"包括任何猪肺炎支原体菌株中具 有免疫原性的蛋白。优选地，所述猪肺炎支原体抗原性蛋白选自猪肺炎支原体J株（NCBI 登录号为：AE017243. 1)、232 株（NCBI 登录号为：AE017332. 1)、7448 株（NCBI 登录号为： AE017244. 1)、7422 株（NCBI 登录号为：CP003802. 1)、168 株（NCBI 登录号为：CP002274. 1)、 168-L株（NCBI登录号为：CP003131. 1)、P株或HN0613株中的免疫原性蛋白。
[0015] 所述猪肺炎支原体抗原性蛋白包括NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋 白、P97Rl-NrdF蛋白或P97R2-NrdF蛋白中的任一蛋白。
[0016] 本发明所用术语"NrdF蛋白"为NrdF全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段， 即 NrdF 全蛋白的 R2 亚基 C 端（Fagan PK, Djordjevic SP, Eamens GJ, et al. Molecular characterization of a ribonucleotide reductase (NrdF) gene fragment of Mycoplasma hyopneumoniae and assessment of the recombinant product as an experimental vaccine for enzootic pneumonia. Infection and immunity, 1996, 64:1060-1064) 〇
[0017] 本发明所用术语"P102蛋白"为P102全蛋白中的具有免疫原性的蛋白片段。 其中，所述P102全蛋白位于P97蛋白下游，并与P97蛋白相邻，且具有细胞粘附作用或 辅助P97蛋白的细胞粘附作用；P102全蛋白分子量为102. 3kD，由2700bp左右编码而 成(Hsu T1Artiushin S1Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology,1997 ,179 (4) :1317-1323 ；Djordievic SP, Cordwell SJ, Djordjecic MA, et al.Proteolytic processing of the Mycoplasma hyopneumoniae cilium adhesin.Infection and immunity, 2004, 72(5):2791-2802)。
[0018] 本发明所用术语"P97R1蛋白"是Mhp纤毛粘附因子P97蛋白编码的C端的 两个重复序列区域之一，由15个连续的5AA (AAKPV/E)基元构成（Hsu T, Artiushin S, Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (4) : 1317-1323) 〇
[0019] 本发明所用术语"P97R2蛋白"是Mhp纤毛粘附因子P97蛋白编码的C端的 两个重复序列区域之一，由4个连续的lOAA(GTPNQGKKAE)基元构成（Hsu T, Artiushin S, Minion FC. Cloning and functional analysis of the P97swine cilium adhesion gene of Mycoplasma hyoneumoniae. Journal of Bacteriology, 1997, 179 (4) : 1317-1323) 〇
[0020] 优选地，所述NrdF蛋白为SEQ ID No. 4编码的蛋白，所述P102蛋白为SEQ ID No. 6 编码的蛋白，所述P97R1蛋白为SEQ ID No. 8编码的蛋白，所述P97R2蛋白为SEQ ID No. 10 编码的蛋白。
[0021] 更优选地，所述NrdF蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No. 3,所述P102蛋白的核苷酸 序列为SEQ ID No. 5,所述P97R1蛋白的核苷酸序列为SEQ ID No. 7,所述P97R2蛋白的核苷 酸序列为SEQ ID No. 9。
[0022] 所述羧基末端部分为含有氨基酸序列KDEL的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14 或 SEQ ID NO. 15。
[0023] 本发明所述羧基末端部分为KDEL家族蛋白中的成员。所用术语"KDEL家族蛋 白"是指一组蛋白质，其具有与细胞内质网膜结合的相似羧基端，并进一步具有可将该蛋 白质留存于内质网腔中以实现醣基化作用的能力，以便融合抗原更接近外源蛋白的肽片 段。通常，该羧基端的长度介于4-16个残基之间。根据针对存在于不同分子中且执行特 定生物机能的相似序列所做的研究显不：一种可在内质网中留存新形成蛋白的序列为Lys Asp Glu Leu(KDEL) (SEQ ID NO. 11)。从而说明：根据这一发明的融合抗原的羧基端上的序 列可作为某种类型的识别序列，协助融合抗原从内吞区室易位至内质网内，并将其留置于 内质网腔内。在一个较佳的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL的序列如SEQ ID NO. 11 所示。在一个更理想的实施方式中，该羧基末端部分包含KDEL-KDEL-KDEL(SEQ ID NO. 12) 或 KKDL-RDEL-KDEL 的序列（SEQ ID NO. 13)、KKDELRDELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 14)或 KKDELRVELKDEL 的序列（SEQ ID NO. 15)，其中 R 为 D 或 V。
[0024] 本发明的另一目的在于提供一种制备所述猪肺炎支原体融合蛋白的方法，所述方 法包括：通过基因工程手段分别获得所述PEA基因、所述猪肺炎支原体抗原性蛋白基因，将 其分别连接至克隆载体以获得PEA克隆载体、猪肺炎支原体抗原性蛋白克隆载体；通过PCR 方法在构建的所述猪肺炎支原体抗原性蛋白基因羧基末端添加含KDEL的多肽序列，并连 接至克隆载体以获得抗原性蛋白-KDEL克隆载体；将构建的所述抗原性蛋白-KDEL克隆载 体、所述PEA克隆载体通过酶切，构建同时包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的克隆载体， 即猪肺炎支原体融合蛋白的克隆载体；将构建的所述猪肺炎支原体融合蛋白的克隆载体、 表达载体通过酶切，构建同时包含PEA、抗原性蛋白-KDEL基因的表达载体，即猪肺炎支原 体融合蛋白的表达载体；将所述猪肺炎支原体融合蛋白的表达载体导入受体菌进行诱导表 达，并对表达的猪肺炎支原体融合蛋白进行纯化和鉴定以获得猪肺炎支原体融合蛋白。
[0025] 优选地，所述基因工程手段是指运用分子生物学方法获得所述PEA基因、所述猪 肺炎支原体抗原性蛋白基因，进一步优选为通过PCR方法扩增PEA基因、通过RT-PCR方法 扩增猪肺炎支原体抗原性蛋白基因；优选地，所述克隆载体为分子生物学可接受的克隆载 体，进一步优选为PMD18-T、pGEM-T、pUC18/19、pBR322 ;优选地，所述表达载体为pET，进一 步优选为pET-28a、pET-32a ;所述受体菌为大肠杆菌，进一步优选为Bal21。
[0026] 本发明的再一目的在于提供一种猪支原体肺炎疫苗组合物，包括免疫量的任一所 述融合蛋白和/或其组合以及兽医学上可接受的佐剂。
[0027] 本发明所用术语"猪支原体肺炎"在临床上的症状包括（但不限于）：呼吸症状 (严重急性临床肺炎、咳嗽、呼吸困难、呼吸速迫）、发热、高度传染性、高发病率、低死亡率、 坏死性细胞支气管炎及继发性细菌性呼吸道感染增加。
[0028] 本发明所用术语"猪支原体肺炎疫苗组合物"是指能够用于预防和/或治疗由猪 肺炎支原体感染所知病症或疾病的疫苗，该疫苗组合物可包括任何能够有效预防和/或治 疗猪受猪肺炎支原体感染的疫苗，能够用于猪支原体肺炎疫苗组合物包括（但不限于）完 全或部分猪支原体肺炎细胞制剂、灭活或改良活体疫苗、亚单位疫苗。
[0029] 本发明所述的猪支原体肺炎疫苗组合物优选为亚单位疫苗，所述"亚单位疫苗"包 含一个或多个猪肺炎支原体衍生的多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质的免疫原性片段， 或编码所述一个或多个猪肺炎支原体衍生多肽或蛋白质，或所述多肽或蛋白质免疫原性片 段的一个或多个猪肺炎支原体基因或核酸，且所述基因或核酸能在猪体内进行表达。猪肺 炎支原体多肽、蛋白质、所述多肽和蛋白质的免疫原性片段、或猪肺炎支原体基因或核酸可 用于本领域公知技术合成或重组制备。
[0030] 本发明所用术语"预防和/或治疗"在涉及猪肺炎支原体感染时是指抑制猪肺炎 支原体细菌的复制、抑制猪肺炎支原体的传播或防止猪肺炎支原体在其宿主体内定居，以 及减轻猪肺炎支原体感染所之疾病或病症的症状。若细菌荷载量减少、肺部感染减轻和/ 或摄食量和/或生长增加，那么就可以认为所述治疗达到了治疗效果。
[0031] 本发明所用术语"猪"是指任何属于猪科（Suidae)成员的动物，如猪。
[0032] 本发明所用术语"免疫量"是指提供针对猪支原体肺炎疫苗组合物的免疫剂量，主 要取决于以下因素：被免疫动物的物种、品种、年龄、重量大小、健康状态以及动物之前是否 接受过对抗同样病毒的疫苗。
[0033] 在本发明的一种优选实施方式中，所述疫苗组合物，包括免疫量的所述融合蛋白 至少任意两种的组合及兽医学上可接受的佐剂。
[0034] 本发明所用术语"佐剂"可包括铝胶佐剂；皂苷（saponin)，如Quil A、 QS-21(Cambridge Biotech Incorporation, Cambridge MA)、GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals Incorporation，Birmingham AL);油包水乳剂；水包油乳剂；水包油包水 乳剂；丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物；顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍生物的共聚物 选出的化合物。
[0035] 本发明所用术语"乳剂"可尤其基于轻液体石錯油（^European Pharmacopea类 型）；因烯经寡聚产生的类异戊二烯油（isoprenoidoil)，如角S烧（squalane)或角S烯 油（squalene oil),尤其异丁烯或葵烯；酸或醇的含线性烧基的酯，更尤其植物油、油酸乙 酯、丙二醇二_(辛酸酯/葵酸酯）、甘油三_(辛酸酯/葵酸酯）或丙二醇二油酸酯；支链 脂肪酸或醇的酯，尤其异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用以便形成乳剂。乳化剂优选非离 子表面活性剂，尤其山梨聚糖的酯、二缩甘露醇（mannide)的酯（如无水甘露醇油酸酯）、 脂肪族二元醇（glycol)的酯、聚甘油（polyglycerol)的酯、丙二醇的酯以及油酸的酯、异 硬脂酸的酯、蓖麻油酸的酯或羟基硬脂酸的酯，它们任选乙氧基化，还有聚氧丙烯-聚氧乙 烯嵌段共聚物，尤其Pluronic产品，特别是L121。参见Hunter等编写的《The theory and practical application of adjuvants)) (Ed. by DES Stewart-Tull, John Wiley and Sons, New York, 1995:51-94)和 Todd 等编写的《Vaccine》（1997, 15:564-570)。例如，可使用 Powell M 和 Newman M 编写的〈〈Vaccine design, the Subunit and adiuvant approach〉〉（Plenum Press, 1995)第147页描述的SPT乳剂及第183页描述的MF59乳剂。
[0036] 本发明所用术语"丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物"优选为交联的丙烯酸或甲基 丙烯酸聚合物，尤其是与糖（sugar)的聚链烯基醚或聚醇交联，这些化合物已知被称为 卡波姆（Carbomer，商品名Carbopol) (Phameuropa, 1996, 8(2))。本领域技术人员还可 参见美国专利US2909462,其描述了这类丙烯酸聚合物，其与聚羟基化的化合物交联，所 述化合物具有至少3个羟基，优选不超过8个，其中至少3个羟基的氢原子被具有至少2 个碳原子的不饱和脂烃基（aliphatic radical)取代。优选的基团是那些含有2-4个碳 原子的基团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯属不饱和基团（ethylenically unsaturated group)。所述不饱和基团自身可包含其它取代基，如甲基。这些产品以卡波普的名义出 售，（BF Goodrich, Ohio, USA)特别合适。它们与烯丙基鹿糖或与烯丙基季戊四醇（allyl pentaerythritol)交联。这其中可提及卡波普974P、934P和971P，最优选使用卡波普971P。
[0037] 本发明所用术语"顺丁烯二酸酐和链烯基衍生物的共聚物"也可考虑顺丁烯二酸 酐与乙烯的共聚物EMA(Monsanto)，这些聚合物在水中溶解产生酸性溶液，经中和，优选中 和至生理pH，以便产生佐剂溶液，能向其中掺入免疫原性、致免疫性或疫苗性组合物本身。
[0038] 本发明所用术语"佐剂"还包括，但不限于，RIBI佐剂系统（Ribi Incorporation)、 Block c〇-polymer(CytRx，Atlanta GA)、SAF_M(Chiron，Emeryville CA)、单憐醜脂质 A(monophosphoryl lipid A)、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热肠毒素（重组或其 它）、霍乱毒素、MS1314、胞壁酰二肽、Gel佐剂等。
[0039] 优选地，所述佐剂为铝胶佐剂、皂苷、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂、 丙烯酸、甲基丙烯酸的聚合物、顺丁烯二酸酐和链烯基（alkenyl)衍生物的共聚物、RIBI佐 剂系统、Block c〇-polymer、SAF-M、单磷酰脂质A、Avridine脂质-胺佐剂、大肠杆菌不耐热 肠毒素、霍乱毒素、IMS1314、胞壁酰二肽或Gel佐剂中的一种或几种。
[0040] 更优选地，所述佐剂在所述疫苗组合物中的体积比为5 % -30 %。
[0041] 优选地，所述疫苗组合物还包括其他抗原，所述其他抗原包括猪圆环病毒抗原、猪 繁殖与呼吸综合征病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪细小病毒抗原、大叶性肺炎放线杆菌抗 原、大肠杆菌抗原、猪萎缩性鼻炎抗原、猪伪狂犬病病毒抗原、猪霍乱病原抗原、猪流感病毒 抗原中的一种或多种；进一步优选地，所述其他抗原为猪圆环病毒抗原。
[0042] 本发明又一目的在于提供所述疫苗组合物在制备预防和/或治疗猪支原体肺炎 的药物中的应用。
[0043] 本发明所用术语"猪肺炎支原体"与"Mhp"在本发明中可互换使用。
[0044] 本发明所用术语"开放阅读框"或"0RF"是指编码不含插入的终止密码子的特定 Mhp蛋白质所需的最小核苷酸序列。
[0045] 本发明所用缩略语为：AA，氨基酸；bp，碱基对；kD，千道尔顿。
[0046] 本发明具有以下突出的优点：
[0047] (1)所述疫苗组合物可通过基因工程手段对其组分进行大量重组表达，不仅耗时 短，还可便于大规模生产；
[0048] (2)所述疫苗组合物既能产生细胞免疫，又能产生体液免疫，能获得较好的免疫保 护。
[0049] 序列表中：
[0050] 序列1为假单胞杆菌外毒素 A结构域I与II的核苷酸序列；
[0051] 序列2为假单胞杆菌外毒素 A结构域I与II的氨基酸序列；
[0052] 序列3为NrdF蛋白的核苷酸序列；
[0053] 序列4为NrdF蛋白的氨基酸序列；
[0054] 序列5为P102蛋白的核苷酸序列；
[0055] 序列6为P102蛋白的氨基酸序列；
[0056] 序列7为P97R1蛋白的核苷酸序列；
[0057] 序列8为P97R1蛋白的氨基酸序列；
[0058] 序列9为P97R2蛋白的核苷酸序列；
[0059] 序列10为P97R2蛋白的氨基酸序列；
[0060] 序列11为羧基末端部分的氨基酸序列1 ;
[0061] 序列12为羧基末端部分的氨基酸序列2 ;
[0062] 序列13为羧基末端部分的氨基酸序列3 ;
[0063] 序列14为羧基末端部分的氨基酸序列4 ;
[0064] 序列15为羧基末端部分的氨基酸序列5 ;
[0065] 序列16为羧基末端部分的核苷酸序列。


[0066] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0067] 本发明实施例中所用的猪肺炎支原体NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋 白的序列，来源于已报道的国际标准株J株，在NCBI中的登录号为AE017243. 1。
[0068] 本发明实施例中，以大肠杆菌表达载体为例进行表达，通过基因工程手段获得猪 肺炎支原体NrdF蛋白、P102蛋白、P97R1蛋白、P97R2蛋白，但该实施方式无论在任何情况 下均不构成对本发明的限定。
[0069] 本发明实施例以Montanide?Gel01 (法国SEPPIC公司）作为佐剂，并以体积比为 10 %的佐剂，制备猪支原体肺炎疫苗组合物为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情况 下均不构成对本发明的限定。
[0070] 本发明实施例中猪支原体肺炎疫苗组合物所含组分分别以：
[0071] (I)PEA-NrdF-KDEL ；
[0072] (2)PEA-P102-KDEL ；
[0073] (3)PEA-P97R1-KDEL ；
[0074] (4)PEA-P97R2-KDEL ；
[0075] (5)PEA-P97Rl-NrdF-KDEL ；
[0076] (6) PEA-P97R2-NrdF-KDEL ；
[0077] (7) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL ;
[0078] (8) PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL ;
[0079] (9) PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0080] (10) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL ;
[0081] (I I) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0082] (12) PEA-NrdF-KDEL、PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL ;
[0083] (13) PEA-NrdF-KDEU PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、 PEA-P97Rl-NrdF-KDEL ;和
[0084] (14) PEA-NrdF-KDEU PEA-P102-KDEL、PEA-P97R1-KDEL、PEA-P97R2-KDEL、 PEA-P97Rl-NrdF-KDEL、PEA-P97R2-NrdF-KDEL为例进行阐述，但该实施方式无论在任何情 况下均不构成对本发明的限定。
[0085] 本发明实施例中所采用的攻毒毒株为猪肺炎支原体CVCC354株，该毒株的保藏号 为CVCC354,保藏单位为国家兽医微生物菌种保藏管理中心。
[0086] 本发明实施例中肺病变指数采用28分法进行评判。所述28分法是根据猪支原体 肺炎的典型肺部眼观病变，对发病程度进行量化判定，包括肺尖叶、心叶、膈叶、中间叶出现 的实质样病变，如"肉样变"、"胰样变"。肺炎病变评分标准为：2个尖叶、2个心叶、2个膈 叶、1个中间叶共计7个肺叶，每个肺叶满分为4分，共计28分。根据发生实质病变的肺叶 面积所占该叶的比例，分别对每个肺叶进行打分。无肺炎病变记为〇分；病变面积比例为 1% -25%，记为1分；病变面积比例26% -50%，记为2分；病变面积比例为51% -75%，记 为3分；病变面积比例为76% -100%，记为4分。如肺叶正反两面均有病变，以病变面积大 的一面进行记分。各个肺叶打分总和即为该发病株的肺炎病变得分。分别对免疫组猪和对 照组猪进行记分后，按照以下公式计算免疫组猪的肺叶病变减少率：
[0087]