专利名称：类风湿关节炎特异性抗原的制作方法类风湿关节炎(RA)是一种以滑膜炎为基本病理改变，以慢性破坏性关节病变为特征的全身性自身免疫病，大多病情呈进行性，最终导致关节纤维性或骨性强直而严重致残，严重影响患者生活质量。未经正确治疗的类风湿关节炎可迁延不愈，甚至导致关节畸形。作为自身免疫性疾病，致病抗原驱动的自身反应性CD4+T细胞活化是类风湿关节炎发病的核心途径。对于类风湿关节炎的诊断，现在主流仍然沿用1987年美国风湿病学学会RA的分类标准，其主要靠临床表现并排除其他关节炎从而对RA进行判断。另外，X线改变和类风湿因子也是判断RA的常用标准。但上述方法操作繁琐且特异性不高，且不适用于早期诊断。众所周知，RA的病理改变从滑膜组织开始逐渐向软骨到骨发展。RA在早期若未得到有效治疗，将会引起关节功能障碍甚至劳动力丧失，并导致全身多脏器受累进而危及生命。如果能尽早对RA病情做出诊断，及早治疗，从而阻止或延缓其发展，将能有效的提高RA 的治疗效果并减少其并发症的发生。而针对RA早期有高度敏感性和特异性的检测指标是实现RA早期诊断和治疗的前提。早期诊断指标中，IL-8、IL-6水平在巨细胞病毒DNA阳性的类风湿关节炎患者中升高和CMV基因组出现之间存在联系，但特异性和敏感性低。在RA自身抗体作为检测指标方面类风湿因子(RF)存在灵敏度低的缺点；在早期RF阴性的类风湿关节炎病人中可 53. 3%的病人抗核周因子(APF)呈阳性，但APF抗原片的保存时间较短(仅为1 2周)，检测稳定性低；Μ抗体在类风湿关节炎中阳性率为40%，特异性为98. 9%，但类风湿关节炎早期仅约23% ；过氧化物还原酶IV (在说明书附图中简称“IV”)和类风湿关节炎的相关性研究尚未有人报道。
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种过氧化物还原酶IV的新应用，该应用是通过在RA滑膜组织中筛选出RA备选抗原，再在备选抗原中筛选出过氧化物还原酶IV并对其抗体在初诊和复诊RA患者血清中通过间接ELISA进行特异性和敏感性检测，过氧化物还原酶IV主要表达于RA病变起始部位滑膜细胞胞浆，过氧化物还原酶IV体外特异性刺激RA患者外周血单个核细胞(PBMC)增殖并分泌RA发病相关细胞因子IL-17、TNF-α和 IFN- γ，所以过氧化物还原酶IV是新的RA疾病相关抗原，该抗体检测的新应用在初诊RA患者血清当中特异性和敏感性高，为类风湿关节炎的早期诊断及治疗提供了新思路。为实现上述目的，本发明的技术方案为过氧化物还原酶IV在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用。进一步，所述过氧化物还原酶IV在制备类风湿关节炎诊断试剂中的应用； 进一步，所述过氧化物还原酶IV在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用； 进一步，过氧化物还原酶IV在制备类风湿关节炎疫苗中的应用。本技术方案分别利用免疫蛋白组学方法在RA滑膜中筛选出RA备选抗原及抗体， 通过TOF-TOF质谱法及免疫蛋白印迹(Western Blotting)法进一步鉴定和验证备选抗原中的五号蛋白点为过氧化物还原酶IV ；利用Western-blot检测RA和骨性关节炎(OA)滑膜组织中过氧化物还原酶IV表达差异；通过免疫组织化学染色方法证实过氧化物还原酶IV主要表达于RA起始病变部位滑膜细胞胞浆；借助间接法ELISA测定过氧化物还原酶IV抗体在 RA血清中的特异性和敏感性；并发现过氧化物还原酶IV抗体滴度在初诊的早期RA患者(病程少于3个月)中明显高于正常人，并且高于经免疫抑制治疗的复诊RA患者；通过细胞增殖实验证实了过氧化物还原酶IV特异性刺激RA外周血单核细胞增殖，并分泌IL-17、TNF- α 和IFN-Y等与RA发病相关细胞因子。根据上述结果，本发明得出如下结论过氧化物还原酶IV为RA特异性疾病相关抗原。在上述研究基础上针对过氧化物还原酶IV抗原进行改造等方式制备疫苗可能为RA的特异性免疫治疗提供新的手段。本发明的有益效果在于过氧化物还原酶IV在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用中，其特异性和敏感性高，尤其适用于早期诊断试剂的应用，过氧化物还原酶IV还为制备类风湿关节炎疫苗中提供了新思路。
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中
图1为RA滑膜组织蛋白点2-D分离后Coomassie blue染色双向凝胶电泳图。图2为RA患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。图3为OA患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。图4为正常人血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。图5为系统性红斑狼疮(SLE)患者血清与图1蛋白点杂交的双向凝胶电泳图。图6为RA滑膜组织中特异性与RA患者血清反应的双向凝胶电泳图，包含12个蛋白点。图7为T0F-T0F蛋白质串联质谱对第5号蛋白点的鉴定图谱。图8为免疫印迹法蛋白定性检测电泳谱，其中A为单向凝胶电泳图(1、2为不同 RA滑膜组织，3、4为Hela细胞阳性对照)，B为RA滑膜组织双向凝胶电泳图。图9为免疫印迹法检测RA患者和OA患者滑膜组织中过氧化物还原酶IV的差异表达电泳图(1、2分别为RA和OA滑膜组织)。图10-A和图10-B为苏木素-依红(HE)染色RA滑膜组织的病理照片图，图10_C 和图10-D为RA滑膜组织过氧化物还原酶IV免疫组化染色的病理照片图。图11为PBMC增殖实验的放射强度(cpm)分析图，其中A为cpm值分析图，B为刺激指数(stimulation index, Si)分析图。图12为CFSE染色流式细胞检测PBMC增殖图。
图13为ELISA法检测过氧化物还原酶IV刺激PBMC IFN- y、IL-17和TNF- α分泌量的分析图，其中，A为IFN-Y的分析图，B为IL-17的分析图，C为TNF-α的分析图。

丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、TEMED、过硫酸铵、十二烷基磺酸钠、Tris、甘氨酸、溴酚蓝、二硫苏糖醇(DTT)、CHAPS、低熔点琼脂糖、低分子量标准蛋白、IPG缓冲液、IPG胶条(pH3_ll L)、IPG 覆盖油、尿素和 PhastGel Blue R 购自 Amersham Pharmacia Biotech ；碘乙酰胺购自Sigma;测序级胰蛋白酶购自！Iomega;蛋白酶抑制剂和ECL Western blot检测试剂盒购自Roche ；甲醇、冰乙酸和无水乙醇购自重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂； 辣根酶标记山羊抗人IgG (H+L)、辣根酶标记山羊抗小鼠IgG (H+L)、Power VisionTM(IgG 抗体-HRP多聚体)复合物和DAB显色试剂盒购自北京中山生物技术公司；鼠抗人过氧化物还原酶IV单克隆抗体购自Abcam公司；Recombinant human过氧化物还原酶IV购自 Lifescience公司；多聚甲醛购自北京化学试剂公司。1. 2 仪器
IPGphor等电聚焦仪、SE600垂直电泳仪、MultiTempIII循环水浴和TE50X电转仪购自 Amersham Pharmacia Biotech公司；550型酶联仪和GS-800图像扫描系统Bio-Rad公司； MALDI-T0F质谱仪购自Bruker公司；低温高速离心机购自中国科学院武汉科学仪器厂；脱色摇床购自江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司；LEICA AM 2135型切片机购自Leica公司；BX-50型Olympus显微镜和PM-20型Olympus显微摄像系统Olympus公司；紫外分光光度仪Backmen公司。主要试剂配制
1.3.1样品裂解液贮液40 mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，质量分数为 4%的 CHAPS，Iml/ 管分装，_70°C冻存。1.3.2 10mg/ml RNase A，_20°C冻存备用。1. 3. 3 mg/ml DNase I，_20°C冻存备用
1. 3. 4 20X蛋白酶抑制剂1粒蛋白酶抑制剂溶解于350 μ L纯水中。1.3.5 1 mol/L DTT，_20°C冻存备用。1. 3. 6 IPG buffer，4°C保存备用。1.3.7样品裂解液工作液40mmol/L Tris, 7 mol/L尿素，2mol/L硫脲，质量分数为 4% 的 CHAPS，100μ g/ml DNase I，25 μ g/ml RNase A, IX 蛋白酶抑制剂，0.8% IPG buffer,60 mmol/L DTT。1. 3. 8溶涨液贮液7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，质量分数为2%的CHAPS，痕量溴酚蓝，-70°C冻存。1. 3. 9溶涨液工作液溶涨液贮液中加入质量分数为1 %的IPG buffer, 60 mmol/ L DTT (临用前加)。1. 3. 10 平衡缓冲液50 mmol/L Tris-Cl pH 8. 8，6 mol/L urea,体积分数为
530%的glycerol，质量分数为2%的SDS，溴酚蓝痕量。1. 3. 11质量分数为0. 5%低熔点琼脂质量分数为0. 5%的低熔点琼脂溶解于 SDS-PAGE电泳缓冲液。1. 3. 12 30%丙烯酰胺贮液30g丙烯酰胺，0. Sg甲叉丙烯酰胺溶解于IOOml纯水中，过滤，4°C贮存于棕色瓶中。1. 3. 13 4X 分离胶缓冲液1. 5 mol/L Tris-Cl (pH 8. 8) 1.3.14 10% SDS IOg SDS 溶解于 50ml H20 中，定容至 IOOml。1. 3. 15 10%过硫酸铵0. Ig过硫酸铵溶解于Iml纯水中。1. 3. 16 SDS-PAGE 电泳缓冲液:94g 甘氨酸，12. Ig Tris, 50ml 10% SDS，溶解于水并定容至1000ml。1. 3. 17考马斯亮蓝染色液贮液溶解1片PhastGel Blue R于80ml水中，搅拌 5-lOmin，加入120mL甲醇，搅拌直至染料完全溶解，过滤溶液备用。1. 3. 18考马斯亮蓝染色液工作液(0. 1% )染色液贮液与体积分数为20%乙酸按体积比为1 :1的比例混合。1. 3. 19脱色液体积分数为30%乙醇，体积分数为10%乙酸溶于水中。1. 3. 20转移缓冲液(39mm甘氨酸，48mmTris碱，质量分数为0. 037%的SDS，体积分数为20%甲醇)称取甘氨酸2. 9g，1Tris碱5. 8g，SDS 0. 037g，并加入200ml甲醇，最后加水补充至总体积为1000ml。1. 3. 21 TBS (50mM Tris 碱，150mM 氯化钠，ρΗ7· 5)称取 6. 05g Tris 碱，8. 76g 氯化钠，用HCl调节pH值至7. 5，加水至总体积为1L，2_8°C保存3个月。1. 3. 22 TBST 将 ImLTween 20 加入 IL TBS 中，2_8°C保存 3 个月。1. 3. 23 封闭液加入IOmL封闭液贮液到90mlTBS中，在-15 _25°C稳定保存。1. 3. 24 0. 5%封闭液加入5mL封闭液贮液到95mLTBS中，在-15 _25°C稳定保存。1.3. 25 一抗(血清)用0. 5%的封闭液稀释一抗。1. 3. 26 POD标记的抗鼠或兔IgG 用100 μ L纯水将冻干粉溶解，得到二抗贮液。 用0.5%的封闭液稀释得到工作液。40mU/mL 二抗通常足够用来检测。该贮液在2_8°C可以保存12个月，但工作液需要新鲜配置。1. 3. 27 ECL检测溶液将溶液A与溶液B以体积比为1 1的比例混合，该溶液现配现用。1. 3. 28 0. OlM PBS :50mL0. 2mol/L PB 加 8. 8g NaCl，双蒸水定容至 IOOOmL01. 3. 29 RIPA 裂解液1.5M Nacl ImL，IOOmM Tris-HCL (pH7. 4) 5mL，加质量分数为 10% SDS IOOuL, 500mM DTT 100uL，NP_40 lOOuL，Complete Mini (蛋白酶抑制剂)1 片，
三蒸水定容至10 mL。1. 3. 30 包被液0. 85M (PH 9. 6)碳酸盐缓冲液1. 59g Na2CO3 加 2. 93g NaHCO3, 三蒸水定容1000mL。
1.3.31洗涤液0. OlM pH7. 4 PBS +吐温-20 (T)使最终质量分数为 0. 05%。1. 3. 32底物溶液磷酸盐-柠檬酸缓冲液(ρΗ5· 0 5· 5) :0. IM柠檬酸Μ. 3mL加入 25. 7ml 0. 2M Na2HPO4 · 12H20加入邻苯二胺40. Omg,定容至50mL，临用前加0. 15mL体积分数为30%的吐02。
1.3. 33终止剂22. 2mL硫酸加入蒸馏水177. 8mL。1.4样品5例RA滑膜组织由北京大学附属人民医院风湿免疫科栗占国教授提供；534例RA (其中初诊67例、复诊467例)、65例OA、120例SLE、10例硬皮病 (scleroderma)、15例皮肌炎(dermatomyositis)及120例正常对照(NC)血液标本源自西南医院。双向凝胶电泳法筛选RA滑膜组织中的备选抗原
2.1样品制备
2. 1. 1取出-70°C冻存的RA滑膜组织样品，室温平衡约lOmin，加入样品裂解液工作液充分研磨，涡旋器上振荡约20-30min后，室温放置l_2h，使细胞蛋白充分溶解，经过超声裂解后 40C 12000rpm 1 小时。2.1.2 样品溶液的蛋白定量(DC Protein Assay, BIO-RAD COMPANY)。2. 1. 2. 1配制蛋白标准液(0. 25mg/ml 1. 5mg/ml蛋白)先将BSA溶解于水配制10mg/mL的BSA母液，然后用样品裂解液稀释成0,0. 25,0. 5,1. OU. 5mg/ml五个不同浓度的BSA溶液。2. 1. 2. 2样品液的稀释用样品裂解液将样品液稀释10、20倍备用。2. 1. 2. 3准备工作液试剂A0 每Iml试剂A加入20 μ L试剂S (该工作液试剂Α0 可稳定1周，即使1天以后形成了沉淀。如果形成了沉淀，加热溶液并振荡。不要用加样枪头吹打，因为容易堵塞枪头而改变加入样品中的试剂体积)。2. 1. 2. 4样品及标准品Α655值的测定吸取5 μ L标准液和样品加入干净、干燥的微孔板。每孔加入25 μ L试剂Α0或试剂Α。每孔加入200 μ L试剂B。15min后，655nm测吸光值。Ih内吸光值稳定。2. 1. 2. 5建立线性方程，计算样品蛋白浓度。实验方法
2. 2. 1 2D-PAGE第一向——等电聚焦
2. 2. 1. 1取出_20°C冻存的IPG strip，室温平衡数分钟。2. 2. 1. 2样品和溶涨液在IPG holder中混合，达到合适的上样量，去掉IPG胶条的保护膜，胶面朝下，避免产生气泡，放入溶涨液中。IPG胶条上覆盖一层矿物油，盖上盖子， 溶涨过夜。2. 2. 1. 3仪器运行参数如下
等电聚焦运行参数温度，20°C ；最大电流，50mA per IPG strip ；样品体积， 350 μ 1 (180mm IPG strip)或 250 μ 1 (130mm IPG strip) ；30V，10-12 小时(溶涨)；200V, 1 小时；500V, 1 小时；500-8000V, 30min ；8000V, 5-6 小时(IPG 3-10L)，6-7 小时(IPG 4-7)。2. 2. 1. 4达到适当的总电压-时间积(Total Volt-hours, Vh)后，取出胶条于平衡液中平衡。2. 2. 2 平衡
2. 2. 2. 1 IOOmg DTT溶解于IOmL平衡缓冲液中(平衡缓冲液I )。取出IPG胶条分别放入玻璃管中，在振荡仪上振荡平衡15min。2. 2. 2. 2 400mg碘乙酰胺溶解于IOmL平衡缓冲液(平衡缓冲液II )，将胶条转移到平衡缓冲液II中，盖上盖，在振荡仪上振荡平衡15min。2. 2. 3 2D-PAGE 第二向-SDS-PAGE


本发明涉及医学领域，特别涉及过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎诊断试剂，所述过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎早期诊断试剂中的应用，过氧化物还原酶Ⅳ在制备类风湿关节炎特异性抗原中的应用中，其特异性和敏感性高，尤其适用于早期诊断试剂的应用，过氧化物还原酶Ⅳ还为制备类风湿关节炎疫苗中提供了新思路。