专利名称：尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒的制作方法膀胱肿瘤以膀胱移行细胞癌多见，60 69岁为发病高峰，在中国的某些大城市， 随着工业化程度的加快和个人饮食，吸烟等生活习惯的改变，其发病率具有明显上升趋势， 且有发病的年轻化趋势。同时膀胱癌的术后复发率极高，约为50-70%，复发时间为1 2年内，其中部分病例伴有肿瘤恶性程度增加或浸润能力增强，严重影响患者的生存期将能够提高患者的治疗效果，延长其生存期。目前医院预防复发的手段，普遍采取术后随访检查， 其手段为B超，膀胱内窥镜和脱落细胞检查。B超易受膀胱其他疾病如膀胱息肉、膀胱粘膜下出血等影响，并且容易漏检< 5mm的肿瘤或平铺在黏膜表面不向腔内突出的病例；而膀胱内窥镜为侵入性检查，同时对操作者技术依赖较高，且价格较贵；此外，尿脱落细胞形态学检查检出率较低，且对早期Ta、Tl期膀胱癌检出率为0。如果能发展一种新的膀胱癌复发的早期筛查手段或辅助检查技术，其在患者膀胱癌发现后就能对患者膀胱癌复发的可能性提供早期判断，对膀胱癌复发风险高的患者和低风险患者提供针对性的手术和化疗，并分别对不同患者进行不同密度的跟踪随访，将对膀胱癌高复发患者人群，大大的提高其治疗效果，减少其复发的可能性，延长其术后生存时间；对膀胱癌低复发患者人群，在提高其治疗效果的同时，将减少某些不必的治疗步骤，减少其术后随访的密度，大大降低其经济上的负担。表观遗传学(Epigenomics)是研究基因在不发生DNA序列改变的情况下，基因功能发生的可遗传的变化，并最终导致了表型的变化的一门学科。表观遗传学主要包括 DNA 甲基化(DNA methylation)，组蛋白修饰(histone modification), microRNA 水平变化等生化过程；DNA甲基化是研究较为深入的表观遗传学机制，在包括诊断和治疗在内的肿瘤临床实践中有着重要的应用前景。DNA甲基化是指生物体内在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,DMT)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。DNA甲基化可以发生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的 N-7位或胞嘧啶的C-5位等。但在哺乳动物中DNA甲基化主要发生在5’ -CpG_3’的C上， 生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在基因组中98%以上的CpG 二核苷酸散在的分布位于具有转录依赖性的转座潜能的重复序列中。在正常细胞中，这些CpG处于高度甲基化/转录沉默的状态，而在肿瘤细胞中这些CpG发生了广泛的去甲基化，导致重复序列的转录、转座子的活化，基因组的高度不稳定性和原癌基因转录增强。余下的占总量2%左右的CpG密集地分布于较小的区域 (CpG岛)。约40-50%的基因启动子区域或其附近存在CpG岛，暗示DNA甲基化可能参与该类基因转录调控机制。在肿瘤细胞中，这些原本在正常细胞中处于低甲基化状态的CpG岛会发生高甲基化而导致基因的转录失活。受影响的基因包括DNA修复基因，细胞周期控制基因和抗凋亡基因等抑癌基因。因此这种肿瘤细胞DNA异常甲基化谱式，已经成为一个新的肿瘤生物标志物研究领域。基因组DNA经亚硫酸氢盐处理后，进行PCR(甲基化特异PCR， MSP)检测可有效地确定受试DNA片段的特定位点的甲基化状态，作为一种定性分析手段， MSP可从含10000个正常细胞的复杂临床样品中检出个位数的甲基化异常的肿瘤细胞，只要这两者受试DNA特定区域的甲基化状态完全相反。这使其对体液中微量DNA进行甲基化分析来诊断肿瘤的方法成为很有希望的肿瘤标记物如支气管肺泡的冲洗液、粪便、血清/ 血浆，以及尿沉淀DNA (如膀胱癌的检测)。尿液中常见细胞为红细胞、白细胞、吞噬细胞、上皮细胞等，且总量可观，大约每50 毫升中有20万左右。膀胱癌病人的尿液中混有少量脱落的肿瘤细胞。鉴于MSP的敏感性， 其可以从10000个正常的alleles中检测出个位数的甲基化allele的敏感性。所以抽提受检膀胱癌患者尿样中的细胞DNA以检测特定的，与复发相关基因的甲基化状况，并以此判定膀胱癌患者复发的风险性是可行的。因此，有必要结合表观遗传学技术，筛选能够在早期阶段判断膀胱癌复发危险性的新的标志物，从而为膀胱癌早期筛查试剂的开发提供途径。
本发明的目的在于提供新的膀胱癌预后复发标志物(尿液标志物)。本发明的另一目的在于提供基于所述标志物的膀胱癌预后复发诊断试剂和试剂品.ο在本发明的第一方面，提供多核苷酸在制备预测膀胱癌复发危险性的试剂中的用途，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO :7(对应人类基因组LMXlA基因启动子相关区域)或 SEQ ID N0:12(对应人类基因组VAXl基因启动子相关区域)所示的核苷酸序列。在本发明的第一方面，提供多核苷酸在制备预测膀胱癌复发危险性的试剂中的用途，所述的多核苷酸具有SEQ ID N0:15或SEQ ID NO :20所示的核苷酸序列。在一个优选例中，所述的SEQ ID NO: 15所示核苷酸序列的多核苷酸是SEQ ID NO 7所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸；所述的SEQ ID NO :20所示核苷酸序列的多核苷酸是SEQ ID NO :12所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸。在另一优选例中，所述的试剂是引物对，选自SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26所示核苷酸序列的引物构成的引物对；或SEQ ID N0:35和SEQ ID NO :36所示核苷酸序列的引物构成的引物对。在本发明的另一方面，提供一种用于预测膀胱癌复发危险性的试剂组合，所述的试剂组合由以下两组引物对组成(1)特异性扩增SEQ ID NO 15所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对；(2)特异性扩增SEQ ID NO 20所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对。在一个优选例中，引物对(1)的核苷酸序列如SEQ ID NO 25和SEQ ID NO 26所示；引物对O)的核苷酸序列如SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36所示。在本发明的另一方面，提供所述的试剂组合的用途，用于制备预测膀胱癌复发危险性的试剂。发明的另一方面，提供一种用于预测膀胱癌复发危险性的检测试剂盒，由以下组件组成容器，以及位于容器中的特异性扩增SEQ ID NO 15所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对(每一条引物位于一个独立的容器中)；和容器，以及位于容器中的特异性扩增SEQ ID NO :20所示核苷酸序列的多核苷酸的引物对(每一条引物位于一个独立的容器中)。在另一优选例中，所述的试剂盒中还包括亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐，DNA纯化试剂，DNA提取试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书(标明检测操作步骤和结果判定标准)。在本发明的另一方面，提供一种体外预测膀胱癌复发危险性的方法，包括(a)提供受试者尿液样品，提取基因组DNA ；(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组 DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在所述的多核苷酸；若是存在所述的多核苷酸，则表明该受试者膀胱癌复发危险性高。在另一优选例中，步骤(c)中，采用核苷酸序列如SEQ ID NO 25和SEQ IDNO 26 所示的引物对或采用核苷酸序列如SEQ ID NO 35和SEQ ID NO 36所示所述的引物对，通过PCR扩增的方式来确定基因组DNA中是否存在所述的多核苷酸。在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的用量为300士200ιι1/μ g基因组DNA ；较佳地，用量为300士 IOOul/μ g基因组DNA ；更佳地，用量为300士50ul/μ g基因组 DNA。在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理的时间是30士20分钟；较佳地为30 士 10分钟；更佳地为30 士 5分钟。在另一优选例中，亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后，还包括将DNA进行脱盐纯化。在另一优选例中，步骤(C)中，采用所述的至少一组试剂，通过PCR扩增的方式来确定基因组DNA中是否存在所述的多核苷酸(经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后的多核苷酸)。在另一优选例中，所述的方法是非诊断性的方法。在另一优选例中，所述的尿液样品为尿沉淀样品，如尿沉渣。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1、145例膀胱癌患者随访信息总结统计，基因LMXlA和VAXl甲基化与复发的相关性，经log rank分析,运用kaplan-meier模型。A =VAXl ；B LMXlA。
6的多核苷酸，包括SEQ ID NO :15(是SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸)或SEQ IDNO :20(是SEQ ID N0:12所示核苷酸序列的多核苷酸经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理后获得的多核苷酸)所示核苷酸序列的多核苷酸。这些多核苷酸可以应用于设计检测试剂或检测试剂盒。检测试剂及试剂盒基于本发明的新发现，还提供了基于所述的多核苷酸序列设计的检测试剂，用于体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，从而判断受试者的膀胱癌复发危险性。所述的试剂例如是引物对，在得知了多核苷酸的序列后，设计引物是本领域技术人员已知的，两个引物在将被扩增的目标基因特定序列的两侧(包含CpG序列在内，与其中CpG互补为针对原为甲基化的基因区，而与其中TpG互补为针对原为去甲基化的基因区)。所述的引物是可特异性扩增选自SEQ ID NO 15或SEQ ID NO 20的多核苷酸。所述的试剂也可以是试剂组合(引物组合)，包括多于一组的引物，从而可分别扩增上述的多条多核苷酸。作为本发明的优选方式，所述的引物对核苷酸序列如SEQ ID NO :25和SEQ ID NO 沈所示；或核苷酸序列如SEQ ID N0:35和SEQ ID N0:36所示。上述引物对扩增获得的扩增产物具有合适的长度，且特异性高，对于复杂体系的扩增也具有良好的特异性，特别适合用于甲基化特异性PCR。本发明还提供了体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的试剂盒，该试剂盒包括容器，以及位于容器中的上述引物对。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、DNA纯化、PCR扩增等所需的各种试剂。此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书，其中标明检测操作步骤和结果判定标准，以便于本领域技术人员应用。检测方法测定多核苷酸的甲基化谱式可通过已有的技术(如甲基化特异性PCR(MSP)或实时定量甲基化特异性PCR，Methylite)来进行，或其它仍在发展中和将被开发出来的技术来进行。检测甲基化水平时也可使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)的方法。这种方法是基于一种荧光PCR的持续性的光学监控，其较MSP方法更为敏感。其通量高并避免了用电泳方法对其结果进行分析。其他可用的技术还有通过甲基化特异性限制性内切酶消化，亚硫酸氢盐 (bisulphite)DNA测序，甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(MS-SnuPE)，限制酶界标基因组扫描(RLGS)，差异性甲基化杂交(DMH) ,BeadArray平台技术(Illumina，USA)，和碱基特异性切割/质谱分析Gequenom，USA)方法。作为本发明的优选方式，还提供了一种体外检测样品中多核苷酸的甲基化谱式的方法。所述的方法基于的原理是亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐可以将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；因而，经过亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理多核苷酸后，甲基化的位点产生类似于一个c/τ的多核苷酸多态性(SNP)。基于上述原理来鉴定检测样品中多核苷酸的甲基化谱式，进而分析受试者的膀胱癌复发危险性。
本发明所述的方法包括包括(a)提供样品，提取基因组DNA ;(b)利用亚硫酸氢盐或重亚硫酸氢盐处理步骤(a)所述的基因组DNA，从而基因组DNA中未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶；(c)分析经步骤(b)处理的基因组DNA中是否存在甲基化谱式异常，若存在高度甲基化(甲基化阳性)，则受试者膀胱癌潜在复发危险性高。对大样品分析(包括与正常和/或非肿瘤对象的比较)将会获得膀胱癌复发相关性基因的甲基化模式，即可通过检测该组基因的甲基化状态来判断受检对象是否为膀胱癌预后较差患者即膀胱癌复发高危人群。本发明的检测方法只需要50ml尿液(较佳地为晨尿)，为无损伤性检测，不给受试者带来痛苦，易于被人们接受和推广。本发明的检测方法操作过程简单，快速，3到4个工作日内可得到结果，非常适合医院膀胱癌辅助检测，术后随访，社区卫生中心对膀胱癌高危人群筛查，体检中心对膀胱癌高危职业从业者筛查。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。本发明共采用膀胱癌临床尿样标本212例；其中157例为原发病例，55例为复发病例，复发病例占25. 94% ；157例原发病例去除12例无法联系的病例，对剩余145例病例进行随访后，有37例病人复发，占25. 5%。尿路其他疾病患者尿样样本41例，其中腺性膀胱炎17例，肾结石5例，尿路感染12例，前列腺炎2例，肾炎3例，炎症性肌纤维母细胞瘤2 例，上述所有病例采集于复旦大学医学院附属中山医院泌尿外科。同年龄正常对照人群尿样样本149例采集自石门二路社区卫生中心。本发明所有进行试验的临床标本，其采集过程符合医学伦理规范，并经伦理委员会同意。膀胱癌病人和对照组临床病理资料整理如表膀胱癌组织病理分级和临床分期(TNM)严格按照UICC第7版 M分期系统。表1、膀胱癌病人和对照组临床病理资料


本发明涉及尿液诊断膀胱癌患者复发危险性的方法和试剂盒。本发明公开了2个甲基化敏感基因，它们是LMX1A、VAX1基因。在检测膀胱癌病人手术前留存尿样，上述基因特定CpG位点在随访确定的复发人群中发生高度甲基化。因此，这2个基因可以作为膀胱癌复发的生物标志物；可作为设计膀胱癌复发预后诊断试剂盒的基础，适用于医院膀胱癌症预后检测，术后随访，社区卫生中心对膀胱癌术后人群监测。