kras基因突变检测液相芯片制作方法_余刚专利（kras,基因突变,液相）-早鸽网

一种kras基因突变检测液相芯片制作方法

专利名称

一种kras基因突变检测液相芯片制作方法
发明者

余刚, 李国强, 秦会娟, 许嘉森
公开日

2011年11月9日
申请日期

2010年4月23日
优先权日

2010年4月23日
申请人

广州益善生物技术有限公司
文档编号

C12N15/11GK102234686SQ20101016077
关键字

kras 基因突变液相芯片检测
权利要求

1.一种KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，主要包括有(A)针对KRAS基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对每种ASPE 引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因突变位点的特异性引物组成，所述tag序列选自SEQ ID NO. 109 SEQ ID NO. 1 中的序列；所述特异性引物是针对Codon 12的、来源于SEQ ID NO. 1或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO. 2 SEQ IDN0. 7中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；针对Codon 13的、来源于SEQ IDNO. 8 或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO. 9 SEQ ID NO. 14中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；和/或针对Codon 61的、来源于SEQ ID NO. 15或其反向互补序列中的碱基序列、和来源于SEQ ID NO. 16 SEQ ID NO. 18中一条以上或其反向互补序列中一条以上的碱基序列；上述特异性引物的3’端的最后3位碱基中任一个碱基为突变位点，所述特异性引物的Tm值在52 58°C之间；(B)分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列选自SEQID NO. 127 SEQ ID NO. 144中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A) 中所选的tag序列互补配对；(C)用于扩增出具有Codon12,Codonl3和/或Codon61的相应突变位点的KRAS基因目标序列的扩增引物2.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述扩增引物为当特异性引物来源于SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 14时，针对Codon 12和Codonl3的扩增引物为 SEQ ID NO. 145 SEQ ID NO. 146 ；当特异性引物来源于 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 14 的反向互补序列SEQ ID NO. 55-SEQ ID NO. 68时，针对Codon 12和Codonl3的扩增引物为 SEQ IDN0. 147 SEQ ID NO. 148 ；针对 Codon61 的扩增引物为 SEQ ID NO. 149 SEQ ID NO. 1503.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述特异性引物为针对Codon 12野生型的SEQ ID NO. 19或SEQ ID NO. 20，以及突变型中的G12R突变位点的 SEQID NO. 21 或 SEQ ID NO. 22、G12S 突变位点的 SEQ ID NO. 23 或 SEQ ID NO. 24、G12C突变位点的 SEQ ID NO. 25 或 SEQ ID NO. 26.G12A 突变位点的 SEQ ID NO. 27 或 SEQ ID NO. 28、 G12D 突变位点的 SEQ ID NO. 29 或 SEQ ID NO. 30、和 / 或 G12V 突变位点的 SEQ ID NO. 31 或SEQ IDN0. 32 ；和/或针对Codon 13野生型的SEQ ID NO. 33或SEQ ID NO. 34、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO. 35或SEQ ID NO. 36、G13S突变位点的SEQ ID NO. 37 或 SEQ ID NO. 38、G13C 突变位点的 SEQ ID NO. 39 或 SEQ ID NO. 40、G13A 突变位点的 SEQ ID NO. 41 或 SEQ IDN0. 42、G13D 突变位点的 SEQ ID NO. 43 或 SEQ ID NO. 44、和 / 或 G13V 突变位点的SEQ ID NO. 45或SEQ ID NO. 46 ；和/或针对Codon 61野生型的SEQ ID NO. 47 或SEQ ID NO. 48，以及突变型中N61H突变位点的SEQ ID NO. 49或SEQ ID NO. 50、N61L突变位点的 SEQ ID NO. 51 或 SEQ IDN0. 52、和 / 或 N61K 突变位点的 SEQ ID NO. 53 或 SEQ ID NO. 54ο4.根据权利要求1所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述特异性引物为针对Codon 12野生型的SEQ ID NO. 73或SEQ ID NO. 74，以及突变型中的G12R突变位点的 SEQID NO. 75 或 SEQ ID NO. 76、G12S 突变位点的 SEQ ID NO. 77 或 SEQ ID NO. 78、G12C 突变位点的 SEQ ID NO. 79 或 SEQ ID NO. 80、G12A 突变位点的 SEQ ID NO. 81 或 SEQ ID NO. 82、G12D突变位点的SEQ ID NO. 83或SEQ ID NO. 84、和/或G12V突变位点的SEQ ID NO. 85或 SEQ IDN0. 86 ；和 / 或针对 Codon 13 Sf 生型的 SEQ ID NO. 87 或 SEQ ID NO. 88、以及突变型中的G13R突变位点的SEQ ID NO. 89或SEQ ID NO. 90、G13S突变位点的SEQ ID NO. 91或 SEQ ID NO. 92、G13C 突变位点的 SEQ ID NO. 93 或 SEQ ID NO. 94、G13A 突变位点的 SEQ ID NO. 95 或 SEQID NO. 96、G13D 突变位点的 SEQ ID NO. 97 或 SEQ ID NO. 98、和 / 或 G13V 突变位点的 SEQ IDNO. 99 或 SEQ ID NO. 100 ；和 / 或针对 Codon 61 Sf生型的 SEQ ID NO. 101 或 SEQ ID NO. 102，以及突变型中 N61H 突变位点的 SEQ ID NO. 103 或 SEQ ID NO. 104、N61L 突变位点的SEQ ID NO. 105或SEQ ID NO. 106、和/或N61K突变位点的SEQ ID NO. 107或 SEQ ID NO. 1085.根据权利要求1-4任一所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述 anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列6.根据权利要求5所述的KRAS基因突变检测液相芯片，其特征是，所述间隔臂序列为 5-10 个 T0
技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及一种KRAS基因突变检测液相芯片
背景技术

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权力要求
说明书
法律状态

专利名称：一种kras基因突变检测液相芯片的制作方法KRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因，KRAS基因突变在胰腺癌、结肠癌和肺癌中都有发现。现已发现的KRAS突变型共有11种，其转变为活性致癌基因的主要原因是 Exon 2的第12、13密码子和Exon 3的第61密码子的发生突变，其中以第12密码子点突变最为常见。第12位密码子点突变在胰腺癌组织中检出率高达71% -100%，在胰液中高达 67% -100%，在血浆中高达27% -81%，在十二指肠液中高达60.9% -66%，而正常胰腺组织、胰岛素瘤及胰腺良性囊肿中均无KRAS基因突变。KRAS蛋白是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导通路中的一个关键的下游调节分子。研究表明，KRAS基因突变与非小细胞肺癌对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。最近的研究还发现KRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥西单抗的治疗产生耐药性。因此KRAS基因的突变可作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗抗性产生的重要预测指标。本发明所开发的KRAS基因突变检测液相芯片涉及的突变位点如下表所示本发明公开了一种KRAS基因突变检测液相芯片，其主要包括有(A)针对KRAS基因的突变位点，分别设计的野生型和突变型的ASPE引物对分别包被有特异的anti-tag序列的、具有不同颜色编码的微球，所述anti-tag序列能相应地与所选的tag序列互补配对；用于扩增出含有Codon 12、Codon 13和/或Codon 61的相应突变位点的KRAS基因目标序列的扩增引物。本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的KRAS基因突变检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现同一位点多种突变型和多种突变位点的并行检测。

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