专利名称：获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用的制作方法目前，我国国家蔬菜种质资源库收集和保存叶用莴苣种质资源200余份，但目前生产上使用的栽培品种多数引自国外。叶用莴苣是一种低投入、高收益、营养价值丰富的速生蔬菜，近年来栽培面积迅速扩大，逐渐成为人们食用的首选绿叶蔬菜之一。但是，我国叶用莴苣的栽培品种主要靠引进国外已有品种，具有自主知识产权的品种和类型很有限，并且在品种资源搜集、鉴定上几乎是空白。因此，需要多角度、多方法开展种质资源的创新工作，开发出品质优良的叶用莴苣新品种，来满足当前生产的需要。种质资源是蔬菜遗传育种和品种改良的基本材料，种质资源的鉴定和筛选是培育和改良优异品种的一项基础工作。由于不同地区之间频繁引种，使得品种名称十分混乱，同物异名和同名异物的现象非常普 遍。所以，鉴定叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系中的有效性，能为叶用莴苣种质资源的收集、保存、利用提供理论依据。现阶段，对于蔬菜的种质资源鉴定，大多用的基于PCR技术的DNA标记技术，可综合为三大类一是以分子杂交为基础的标记技术,主要是RFLP (Restriction Fragment LengthPolymorphism)及 VNTR(Variable number tandem repeat)；二是以 PCR 为基础的标记技术，如 RAF1D(Random Amplified Polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)、STS (Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)> ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)、 DAF(DNAAmplified Fingerprinting)及 ERPAR(Ex-tended Random Primer Amplified Regions)等;三是酶切和PCR相结合的标记技术，主要有AFLP(Amplified ragment LengthPolymorphism)和 CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)。此外，还有一类新近发展起来的基于单个核苷酸多态性的DNA标记，即SNP(Simple NucleotidePolymorphism)。随着逆转座子研究,一项基于反转录转座子的植物分子标记技术-RTN技术得到了很大的发展，主要有 SSAP(Sequence-1 Variation Polymorphism) >RIAP(InverseRetrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP(Retrotransposon based InsertionPolymorphism)等5种。选择何种方法对叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系进行鉴定是急需解决的问题。
本发明实施方式提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用，可以解决目前不能对叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系进行有效鉴定的问题。解决上述技术问题的技术方案如下本发明实施方式提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，其为以下引物组合中的任一组E39/M58、E40/M55、E41/M56、E50/M78、E75/M65、E75/M66、E75/M64、E76/M64、E78/M65 或 E75/M63。本发明实施方式还提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法，该方法包括以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用上述的引物进行PCR扩增得到扩增产物；将上述步骤得到的所述扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染显色法显示DNA条带；选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图。 本发明实施方式进一步提供一种上述的引物组合在获得叶用莴苣的聚类分析图中的应用。本发明实施方式又提供一种叶用莴苣的聚类分析图，利用上述的方法获得。从上述提供的技术方案中可以看出，本发明实施方式中，利用确定的引物组合，可以通过AFLP的方法，获得叶用莴苣的聚类分析图，多态性高、稳定性强、可重复性好、样品适应性广，将在叶用莴苣亲缘关系鉴定，不同品种杂交，以及不同地域间品种引种等领域中发挥重要作用，能为叶用莴苣种质资源的收集、保存、利用提供理论依据，可以有效鉴定叶用莴苣种质资源遗传多样性和亲缘关系。本实施例还提供一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法，该方法包括以叶用莴苣的基因组DNA为模板，用上述权利要求I所述的引物进行PCR扩增得到扩增产物；将上述步骤得到的所述扩增产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离DNA标记，用银染显色法显示DNA条带；选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图。上述方法的选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，采用非加权组平均法进行聚类分析得出聚类分析图步骤，具体可通过以下方式实现(I)根据扩增带的强弱及清晰度确定遗传变异的带，淘汰假象带； (2)在电泳图谱中进行比较，确定单态带和多态带；(3)选取电泳平板上清晰可辨的电泳条带，以“I”和“0”分别记录条带的有无，在同一迁移距离上有带赋值为“ 1”，无带赋值为“0” ;将整个分子标记图转化为0/1矩阵输入P0PGENEI. 32软件进行分析；计算个体间的Nei相似系数(Nei&Li，1979)，其公式为Sc =2Nab/ (Na+Nb+Nab)，其中，Na表示样品A特有的带数；Nb表示样品B特有的带数；Nab表示样品A和样品B共有的带数。用NTSYSpc2. 10软件进行UPGMA聚类分析，生成聚类分析图。本实施例提供一种上述引物组合在获得叶用莴苣的聚类分析图中的应用。下面结合具体获取过程对上述方法作进一步说明本实施例利用上述引物组合通过AFLP分子标记方式对叶用莴苣的73个品种进行聚类分析获得聚类分析图的方法，具体操作流程为制备模板DNA —利用引物组合进行DNA扩增一电泳一银染显色一统计分析结果。具体方法和过程如下(I)使用改良的CTAB法提取的叶用莴苣基因组DNA，提取的基因组DNA经核酸蛋白测定仪(Eppendorf Biophotometer)测定 OD260/OD280 值在 I. 7 I. 9 范围内；将 DNA 提取液稀释成IOOng/ y I,取I DNA样品加入I y I上样缓冲液(loading buffer)稀释液，在I %的琼脂糖凝胶上检测，稳压4V/cm，电泳45分钟；电泳结果显示，DNA主带清晰，无降解现象，RNA去除干净，可以作为模板DNA ；(2)AFLP引物的设计和筛选在AFLP分子标记方式操作中，不同引物组合对某一特定基因组的扩增效率是不同的，引物扩增效率的高低由它产生的多态性条带数决定。本实验对34对引物组合进行分别进行扩增，从中筛选出了 11对谱带分布均匀，条带丰富，多态性较高且谱带质量较好的引物组合，可用于提供样品种质资源遗传多样性研究，这十一对引物如下引物组合I :E39/M58 ；GACTGCGTACCAATTC ATG/GATGAGTCCTGAGTAA CGT引物组合2 E40/M55 ；GACTGCGTACCAATTC AGC/GATGAGTCCTGAGTAA CGA引物组合3 E41/M56 ；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGC引物组合4 E41/M57 ；GACTGCGTACCAATTC AGG/GATGAGTCCTGAGTAA CGG引物组合5 E50/M78 ；GACTGCGTACCAATTC CAT/GATGAGTCCTGAGTAA GTT引物组合6 E75/M65 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAG引物组合7 E75/M63 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAA引物组合8 E75/M66 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA CGA引物组合9 E75/M64 ；GACTGCGTACCAATTC GTA/GATGAGTCCTGAGTAA GAC引物组合10 E76/M64 ；GACTGCGTACCAATTC GTC/GATGAGTCCTGAGTAA GAC引物组合11 :E78/M65 ；GACTGCGTACCAATTC GTT/GATGAGTCCTGAGTAA GAG(3)利用上述⑵的任一组引物组合对DNA进行扩增首先按如下PCR扩增程序进行预扩增94°C预变性3分钟一(94°C变性30秒—50°C复性30秒一72°C延伸I分钟)扩增30个循环一72°C延伸10分钟一4°C。然后，取5 ii L稀释后的预扩增产物，加入表3-4的混合体系中，最后补ddH20至20 ii L，按如下PCR扩增程序进行选择性扩增95°C预变性5分钟一(95°C变性35秒一65°C复性35秒(每循环降低0. 70C ) — 72°C延伸I分钟)2个循环一(94°C变性30秒一56°C复性30秒一72°C 延伸I分钟)23个循环一72°C延伸10分钟一4°C。表I为AFLP扩增统计结果表I为AFLP扩增统计结果


本发明公开了一种获得叶用莴苣的聚类分析图的方法、引物组合及应用，属于生物种质分析领域。该获得叶用莴苣的聚类分析图的引物组合，包括(1)E39/M58(2)E40/M55(3)E41/M56(4)E50/M78(5)E75/M65(7)E75/M66(8)E75/M64(9)E76/M64(10)E78/M65(11)E75/M63中的任一组。基于PCR技术的分子标记法AFLP，应用所述专用引物获得的叶用莴苣聚类分析图谱也属于本发明的保护范围。本发明获得的叶用莴苣聚类分析图谱多态性高、可靠稳定性强，将在叶用莴苣亲缘关系鉴定，不同品种杂交，以及不同地域间品种引种等领域中发挥重要作用。