专利名称：一种莴苣原生质体的提取方法莴苣(Lactuca sativa L.)为一年或者两年生草本植物，属菊科莴苣属，莴苣可分为茎用和叶用两种类型。茎用莴苣肉质鲜嫩，可生食、凉拌、炒食、干制或腌制；叶用莴苣主要食用叶片或叶球。莴苣含有丰富的胡萝卜素、硫胺素、核黄素以及钙、磷、铜、碘、锰等矿物质营养，碳水化合物的含量较低，而无机盐、维生素则含量较丰富，尤其烟酸的含量颇丰， 系胰岛素激活剂，糖尿病患者食之有益；莴苣中钾离子含量为钠盐的27倍，有利于体内水盐平衡，对于高血压、心脏病患者有益，具有降低血压和预防心率紊乱的作用。莴苣叶绿素能滋润皮肤，清洁口腔；莴苣还有增进食欲、刺激消化液分泌、促进胃肠蠕动等功能。莴苣内含有多种重要化学物质，能中和消化过程中所产生的酸，有利于消化器官更好地吸收食物营养。生食莴苣，其Vc不致被破坏，有利于人体健康。莴苣叶的营养成分超过其茎部，被美食家誉为“绿色精灵”。近年来的研究发现，莴苣中的一种芳香烃羟化脂，能够分解食物中的致癌物质亚硝胺，对于肝癌、胃癌癌细胞的形成有一定的预防作用，也可减轻癌症患者放疗或化疗的反应。莴苣广泛栽培于世界各地，已成为人们喜爱的主要蔬菜。在一定程度上对莴苣进行种质创新，同样适应现代化社会发展的需求。通过原生质体培养能得到由单细胞衍生出来的体细胞克隆，这是植物筛选高产，稳定细胞系的良好途径。因为莴苣的原生质体含有其个体的全部遗传信息，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的；原生质体能够克服性细胞的不亲和障碍，便于进行远缘体细胞杂交，从而获得远缘杂种；原生质体可直接摄取外缘的DNA、细胞器、病毒、质粒等，是进行遗传转化研究的理想受体，可以获得转基因莴苣；莴苣原生质体培养过程中，会产生一些次生代谢物，在技术成熟的条件下可以分离提取；因此利用原生质体培养途径进行莴苣的种质资源创新不失为一种可行且有效的途径。
本发明的目的是提供一种莴苣原生质体的提取方法，该方法由莴苣无菌苗的培养、原生质体的质壁分离、原生质体的酶解以及原生质体的纯化四个步骤完成。该方法以提高莴苣原生质体的活力，简单易于操作，分离材料易于得到，酶解的方法简单，去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。本发明所述的一种莴苣原生质体的提取方法，按下列步骤进行a、取莴苣种子，用自来水流动冲洗40-120 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒10-60s，用0. 1%升汞灭菌2-10 min，再用无菌水冲洗4_6次；b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS，温度20 士 1 °C，光照2500-3000 lx，时间16 h/d，培养时间15-35d ；C、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎后浸入原生质体清洗液+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理1-4小时；d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片置于pH5.4-6. 2的酶液中，温度20-28°C， 转速40-80rpm，黑暗条件下震荡12-16小时进行酶解；e、将步骤d中的叶片组织，用300-500目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体，弃去上清液，加入原生质体清洗液+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液+15-25%的蔗糖溶液上， 1000r/min条件下离心5-lOmin，即可得到处于中间部分的莴苣原生质体。步骤b中的诱导培养基中含有蔗糖25_35g/L和琼脂6_8g/L，pH值为5. 8。步骤d中所述酶液为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1_2%，离析酶 0. 2-0. 8%,甘露醇 9%-13%，2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)3_7mmol/L，庆大霉素 0. 1-0. 5mg/ L,四环素0. 1-0. 5mg/L,氨苄3_5mg/L混合均勻。本发明所述方法简单易于操作，分离材料易于得到，方法实用。酶解的方法简单， 去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。


图1为本发明酶解和纯化后的莴苣原生质体图。

a、取莴苣种子，用自来水流动冲洗120min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒45s，0. 1%升汞灭菌5 min,无菌水冲洗4次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖30/L和琼脂7g/L中，pH 值为5. 8，温度20士 1 °C，光照30001x，时间16 h/d，培养20d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在25°C黑暗条件下，处理2小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.75的酶液中，在温度25°C、 转速54rpm摇床上黑暗条件下震荡12小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1%，离析酶0.2%，甘露醇9%，2_ (N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素0. lmg/L,四环素0. lmg/L,氨苄4mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用300目的细胞筛过滤，然后500r/min离心5min沉淀原生质体，弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW) +13%甘露醇的清洗液，轻轻混勻，进行原生质体清洗，1000r/min离心5min弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质 4体清洗液(CPW) +21%蔗糖的溶液上，1000r/min条件下离心6min，取中间部分即为分离纯化后得到的莴苣原生质体；
再将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为4. 92Χ105个。实施例2:
a、取莴苣种子，用自来水流动冲洗40min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒60s，0. 1%升汞灭菌10 min，无菌水冲洗5次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖25g/L和琼脂6g/L，pH值为 5. 8，温度 20士 1 °C，光照 30001x，时间 16 h/d，培养 15d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理2小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.75的酶液中，温度28°C、转速40rpm黑暗条件下震荡12小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1. 5%,离析酶0. 4%,甘露醇10%，2- (N-吗啡啉)乙磺酸，3mmol/L，庆大霉素 0. lmg/L,四环素0. lmg/L,氨苄3mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用300目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+15%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心5min，取处于中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为 0. 567Χ105 个。实施例3:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗60 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒20s, 0. 1%升汞灭菌lOmin，无菌水冲洗6次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，pH值为 5.8，温度20士11，光照 260011，时间 16 h/d，培养 20d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理1小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.75的酶液中，在温度20°C、 转速60rpm黑暗条件下震荡16小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1%，离析酶0.8%，甘露醇13%，2_ (N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素 0. 5mg/L,四环素0. 5mg/L,氨苄3mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用400目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心lOmin，取处于中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为 2. 72Χ105 个。实施例4:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗100 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒40s，0. 1%升汞灭菌4 min,无菌水冲洗4次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖25g/L和琼脂8g/L，pH值为 5. 8，温度 20士 1°C，光照 28001x，时间 16 h/d，培养 25d ；
C、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理1小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.4的酶液中，温度25V、转速SOrpm黑暗条件下震荡14小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1. 5%,离析酶0. 2%,甘露醇11%，2- (N-吗啡啉)乙磺酸7mmol/L，庆大霉素 0. 2mg/L,四环素0. 2mg/L,氨苄5mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用500目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+25%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心6min，取出中间部分的莴苣原生质体，
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数。计数结果为 2. 68Χ105 个。实施例5
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗80 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒30s，0. 1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗6次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖35g/L和琼脂8g/L，pH值为 5.8，温度20士11，光照 300011，时间 16 h/d，培养 35d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理3小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.4的酶液中，温度25V、转速50rpm黑暗条件下震荡12小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1. 5%,离析酶0. 5%,甘露醇13%，2- (N-吗啡啉)乙磺酸7mmol/L，庆大霉素 0. 2mg/L,四环素0. 2mg/L,氨苄4mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用300目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+22%的蔗糖溶液上，lOOOr/min条件下离心lOmin，取出中间部分的莴苣原生质体；将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数。计数结果为 1. 287Χ105 个。实施例6:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗100 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒25s，0. 1%升汞灭菌6 min,无菌水冲洗5次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖35g/L和琼脂7g/L，pH值为 5. 8，温度 20士 1°C，光照 25001x，时间 16 h/d，培养 25d ；
C、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理3小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH6.0的酶液中，温度25V、转速60rpm黑暗条件下震荡14小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶1. 5%,离析酶0. 8%,甘露醇9%，2- (N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素 0. 3mg/L,四环素0. 3mg/L,氨苄4mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用300目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心6min，取出中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为 0. 83Χ105 个。实施例7:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗60min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒25s，0. 1%升汞灭菌6min，无菌水冲洗4次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖30g/L和琼脂8g/L，pH值为 5.8，温度20士11，光照 255011，时间 16 h/d，培养 30d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理2. 5小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH6.2的酶液中，温度25°C、转速 60rpm黑暗条件下震荡11小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶2%，离析酶0. 2%,甘露醇13%，2-(N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素0. Img/ L,四环素0. lmg/L,氨苄4mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用400目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+20%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心5min，取出中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为 1. 487X 105 个。实施例8:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗80 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒60s，0. 1%升汞灭菌8min，无菌水冲洗6次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖28g/L和琼脂7g/L，pH值为 5.8，温度20士11，光照 265011，时间 16 h/d，培养 25d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在温度25°C黑暗条件下，处理4小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.85的酶液中，温度25°C、转速75rpm黑暗条件下震荡16小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶2%，离析酶0. 5%,甘露醇9%，2-(N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素0. Img/ L,四环素0. lmg/L,氨苄4. 5mg/L混合均勻；
e、将步骤d中的叶片组织，用300目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+21%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心lOmin，取出中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数。计数结果为 1. 17Χ105 个。实施例9:
a取莴苣种子，用自来水流动冲洗40 min，然后将种子在超净工作台上用75%酒精表面消毒10s，0. 1%升汞灭菌2min，无菌水冲洗4次；
b、将步骤a中处理后的莴苣种子接入诱导培养基1/2MS、蔗糖28g/L和琼脂7g/L，pH值为 5.8，温度20士11，光照 285011，时间 16 h/d，培养 35d;
c、将步骤b中培养出的无菌苗，切碎以后浸入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇溶液中进行质壁分离，在25°C黑暗条件下，处理4小时；
d、将步骤c中的质壁分离液慢慢倒出，将叶片Ig置于pH5.8的酶液中，温度25°C、转速 60rpm黑暗条件下震荡12小时进行酶解，酶液成分为将原生质体清洗液中加入重量百分比纤维素酶2%，离析酶0. 8%,甘露醇11%，2-(N-吗啡啉)乙磺酸5mmol/L，庆大霉素0. Img/ L,四环素 0. lmg/L,氨苄 4mg/L ；
e、将步骤d中的叶片组织，用500目的细胞筛过滤，然后500r/min离心沉淀原生质体， 弃去上清液，加入原生质体清洗液(CPW)+13%甘露醇的清洗液混勻，进行原生质体清洗，弃去上清液，将原生质体的沉淀用移液枪吸出铺在原生质体清洗液(CPW)+25%的蔗糖溶液上，1000r/min条件下离心9min，取出中间部分的莴苣原生质体；
将步骤e中分离纯化的莴苣原生质体进行检测取ΙΟΟμΙ放于Iml的离心管中用于镜检，首先使用奥林巴斯显微镜，在40倍物镜下观察原生质体的得率，再通过酚藏花红进行染色、制片，在同样的倍数下观察活细胞的情况，用血球计数板对原生质体计数，计数结果为 2. 147X 105 个。


本发明涉及一种莴苣原生质体的提取方法，该方法由莴苣无菌苗的培养、原生质体的质壁分离、原生质体的酶解以及原生质体的纯化四个步骤完成。该方法以提高莴苣原生质体的活力，简单易于操作，分离材料易于得到，酶解的方法简单，去除细胞壁条件温和，分离的原生质体得率高，活性强，易于莴苣原生质体的培养和植株再生，为原生质体融合奠定了基础。另外原生质体的超低温保存对于有优良性状的种质资源的保存也有极其重要的价值。