专利名称：具有肽骨架和c-末端修饰的经修饰补体抑素的制作方法在整篇说明书中引用了各种各样的出版物，包括专利、已公布的申请、技术文章和学术文章。这些被引用出版物中的每一个均在此全文收编作为参考。人补体系统是防御病原生物和介导免疫应答中的有效成份。补体可通过三个不同的途径被活化经典途径、外源凝集素途径和旁路途径。全部三种途径所共有的主要活化事件是补体系统的首要蛋白质C3经由C3转化酶被蛋白水解成它的活化产物C3a和C3b。这些片段的产生引起了经由Ob和iC!3b对病原细胞的调理作用，一种使得它们易于被吞噬或清除的过程，并经由与补体受体的相互作用引起免疫细胞的活化(MarkieWski & Lambris， 2007，Am J Pathol 171:715-727)。C!3b在靶细胞上的沉积还诱导了新的转化酶复合物的形成并由此引发自我扩增环。血浆和细胞表面结合蛋白质的全体小心调节补体激活以防止宿主细胞被补体级联自我攻击。不过，补体的过度活化或不适当调节可导致许多病理情况，范围从自身免疫到炎症性疾病(Holers，2003，Clin Immunol 107 :140-51 ；Markiewski & Lambris，2007， 见前文；RiCklin & Lambris，2007，Nat Biotechnol 25 :1265-75 ；Sahu et al. ,2000, J Immunol 165:2491-9)。因此开发治疗性的补体抑制剂是非常合乎需要的。在此背景下，C3 和C3b由于其在级联中的中心作用允许同时抑制补体起始、扩增和下游活化而成为了有希望的靶标(Ricklin & Lambris，2007，见前文)。补体抑素(compstatin)是据显示能阻断全部三条激活途径的第一种非宿主来源的补体抑制剂(Sahu et al. , 1996, J Immunol 157 :884-91 ；U. S. Patent 6，319，897)。此环式十三肽结合C3和Ob 二者，并阻止天然C3被C3转化酶所裂解。通过利用实验模型进行的一系列研究证实了它的高抑制效力，表明了其作为治疗剂的潜力(Fiane et al. , 1999a, Xenotransplantation 6 :52-65 ；Fiane et al. ,1999b, Transplant Proc31 :934-935 ； Nilsson et al.，1998 Blood 92 :1661-1667 ；Ricklin &Lambris,2008, AdvExp Med Biol 632 :273-292 ；Schmidt et al. ,2003, J Biomed Mater Res A 66 :491-499 ；Soulika et al. ,2000, Clin Immunol96 =212-221) 0对补体抑素的逐渐优化已得到了具有改善活性的类似物(Ricklin & Lambris，2008，见前文；W02004/(^6328 ；W02007/062249)。这些类似物之一目前正在为治疗年龄相关黄斑变性(AMD)所进行的临床试验中进行测试，黄斑变性是工业化国家中老年患者失明的主要原因(Coleman et al.，2008，Lancet 372 :1835-1845 ；Ricklin & Lambris，2008，见前文)。鉴于其在AMD和其它疾病中的治疗潜力，进一步优化补体抑素以获得更高效力是相当重要的。早先的结构-活性研究已确定了补体抑素肽的环状特性以及β-转角和疏水簇二者的存在是该分子的关键特征(Morikis et al.，1998，Protein Sci 7:619-627; W099/13899 ；Morikis et al.，2002，J Biol Chem 277 :14942-14953 ；Rieklin & Lambris， 2008，见前文)。已发现第4和第7位的疏水残基尤其重要，用非天然氨基酸对它们进行修饰产生了活性比原始补体抑素肽高沈4倍的类似物(Katragadda et al. ,2006, J Med Chem 49 :4616-4622 ；W02007/062249)。尽管先前的优化步骤已基于联合筛选试验、溶液结构和计算模型(Chiu et al., 2008, Chem Biol Drug Des 72 :249-256 ；Mulakala et al. ,2007, Bioorg Med Cheml5 1638-1644 ；Ricklin & Lambris，2008，见前文)，但最近公布的补体抑素与补体片段C3c复合的共结晶结构(Janssen et al.，2007，J Biol Chem 282 :29241-29247 ；W02008/153963) 代表了开始合理优化的重要里程碑。晶体结构揭示了 C3c之巨球蛋白(MG)结构域4和5 界面处的浅表结合位点并显示了这13个氨基酸中有9个是直接涉及结合的，这种结合或者经由氢键或者经由疏水作用。当与溶液中的补体抑素肽结构相比时(Morikis et al., 1998，见前文)，结合形式的补体抑素经历了构象改变，β -转角的位置从残基5-8转换到残基 8-11 (Janssen et al·，2007，见前文；W02008/153963)。鉴于上述，很显然开发具有更高活性的经修饰补体抑素肽或模拟物会在本领域内构成重要的进展。发明简述本发明提供了补体抑制肽——补体抑素(ICVVQDWGHHRCT(环状C2-C12)SEQ ID NO 1)的类似物和模拟物，它们的补体抑制活性较补体抑素而言有所改善。本发明一方面的特征在于包含修饰的补体抑素肽(ICVVQDWGHHRCT (环状 C2-C12) ；SEQ ID NO=D或其类似物的化合物，其中第8位的Gly被修饰以限制所述肽在该位置处的骨架构象。在某一实施方案中，通过用N-甲基甘氨酸取代甘氨酸而对骨架加以约束。所述肽可能经由一种或更多种所述方式被进一步修饰用丙氨酸取代第9位的组氨酸； 用色氨酸或色氨酸类似物取代第4位的缬氨酸；用色氨酸类似物取代第7位的色氨酸；N末端残基乙酰化；以及用异亮氨酸、亮氨酸、Nle、N-甲基苏氨酸或N-甲基异亮氨酸取代第13 位的苏氨酸。在一些具体的实施方案中，第4位的色氨酸类似物是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸，并且第7位的色氨酸类似物若存在的话则是商代色氨酸。某些实施方案的特征在于包含具有序列SEQ ID NO 2的肽的补体抑素类似物，其是Xaal-Cys-Val-Xaa2-Gln-Asp-Xaa3-Gly-Xaa4-His-Arg-Cys-Xaa5 (环状 C2-C12)，其中第8位的甘氨酸被修饰以约束所述肽在该位置处的骨架构象，并且其中 Xaal 是 Ile，Val，Leu，Ac-Ile，Ac-Val，Ac_Leu 或含 Gly-Ile 的二肽；Xaa2 是 Trp 或 Trp 的类似物，其中所述Trp类似物具有较Trp而言提高的疏水特性是Trp或含有对其吲哚环之化学修饰的Trp类似物，其中所述化学修饰提高了吲哚环的氢键潜能是His， Ala，Phe 或 Trp ；而 Xaa5 是 Thr，lie, Leu, Nle, N-甲基 Thr 或 N-甲基 lie，其中 Thr，lie, Leu，Nle，N-甲基Thr或N-甲基Ile中任意残基的羧基末端-OH任选的被-NH2所取代。5在某些实施方案中，Xaa2参与与C3的非极性相互作用。在其它实施方案中，Xaa3 参与与C3的氢键。在多种实施方案中，Xaa2的Trp类似物是卤代色氨酸，诸如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。在其它的实施方案中，处的Trp类似物在第5号位置处包含低级烷氧基或低级烷基取代基，例如5-甲氧基色氨酸或5-甲基色氨酸。在其它实施方案中，Xaa2处的Trp类似物包含在第1位的低级烷基或低级烯酰基取代，代表性的实施方案是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸。在其它实施方案中，Xaa3的Trp类似物是卤代色氨酸诸如5-氟-1-色氨酸或6-氟-1-色氨酸。在具体的实施方案中，Xaa2是1-甲基色氨酸或1-甲酰基色氨酸，而)(aa3任选地包含5-氟色氨酸。在某些实施方案中，第8位的Gly被N-甲基化，而fetal是Ac_Ile，是1_甲基-Trp 或 1-甲酰基-Trp, Xaa3 是 Trp，Xaa4 是 Ala，而 Xaa5 是 Thr，lie, Leu, Nle, N-甲基Thr或N-甲基lie。特别是，)(aa5可能是lie，N-甲基Thr或N-甲基lie。特别是，补体抑素类似物包含SEQID NOS :5，7，8，9，10或11中的任一个。在有些实施方案中，所述化合物包含由编码所述肽之多核苷酸表达所产生的肽。 在其它实施方案中，所述化合物至少部分是经由肽合成产生的。也可使用合成方法的组合。本发明另一方面的特征是任何前述权利要求的化合物，其中进一步包含延长所述化合物的体内停留的额外组分。在某一实施方案中，所述额外组分是聚乙二醇(PEG)。在另一实施方案中，所述额外组分是白蛋白结合小分子。在另一实施方案中，所述额外组分是白蛋白结合肽。所述白蛋白结合肽可能包含序列RLIEDICLPRWGCLWEDD(SEQ ID NO :14)。一些具体的实施方案包含与白蛋白结合肽连接之SEQ ID N0S:5，7，8，9，10或11中任一所示序列。任选的，所述化合物和白蛋白结合肽被间隔基隔开。所述间隔基可以是聚乙二醇(PEG) 分子，诸如小型-PEG或小型-PEG3。本发明另一方面的特征是抑制补体激活的化合物，其中包含SEQ IDNO =5,7,8,9, 10或11中任一序列的非肽或者部分肽模拟物，其中所述化合物与C3结合，并且在同等测定条件下时其抑制补体激活的活性比含SEQ ID NO 1的肽高至少500倍。正如本领域已知以及本文以更多细节所描述的，对于采用补体抑素本身的任何目的而言，本发明的补体抑素类似物、缀合物和模拟物是有实际效用的。这些用途中的一些包括将所述化合物配制成药物组合物用于施用于患者。这样的制剂可能包含所述化合物的制药学可接受盐，以及一种或多种制药学可接受稀释剂、载体赋形剂等等，这些均在技术熟练人员的能力范围内。本发明的各种特征和优势可参考以下详述、附图和实施例进行理解。例证性实施方案的详述定义整篇说明书和权利要求使用了涉及本发明方法和其它方面的各种术语。除非另外指出，否则这些术语具有其在本领域内的常规含义。其它特别定义的术语以与本文所提供的定义一致的方式进行理解。术语“大约”在本文中针对可测量的数值诸如用量、持续时间段等等时，意味着包括距给定值士20%或士 10%、在某些实施方案中为士5%、在某些实施方案中为士 1%、以及在某些实施方案中为士0. 的变化，因为这样的变化对于制造和使用所述公开化合物和组合物而言是适当的。术语“补体抑素”用于此处指包含SEQ ID NO 1即ICVVQDWGHHRCT (环状C2-C12) 的肽。术语“补体抑素类似物”指包含如本文所进一步详述以及如本领域所已知的天然和非天然氨基酸或氨基酸类似物取代以及在各个氨基酸之中或之间的修饰的经修饰补体抑素。 当提及补体抑素或补体抑素类似物内具体氨基酸或类似物定位时，那些定位有时被称为肽内的“位置”，这些位置编号为从1(补体抑素内的lie)至13(补体抑素内的Thr)。例如， Gly残基占据了“第8位”。术语“药用活性，，和“生物学活性，，指本发明化合物结合C3或其片段并抑制补体激活的能力。如本文所进一步详述的，此生物学活性可通过数个本领域所公认的检验中的一种或多种进行测量。用于此处时，“烷基”指具有大约1至大约10个碳原子的任选取代的饱和直链、 分支的或环状的烃类(以及其中碳原子范围和具体数目的所有组合和亚组合)，优选具有大约1个至大约7个碳原子。烷基包括但不局限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、环戊基、异戊基、新戊基、正己基、异己基、环己基、环辛基、金刚烷基、 3-甲基戊基、2，2_ 二甲基丁基和2，3_ 二甲基丁基。术语“低级烷基”指具有大约1至大约 5个碳原子的任选取代的饱和直链、分支的或环状的烃类(以及其中碳原子范围和具体数目的所有组合和亚组合)。低级烷基包括但不局限于甲基、乙基，正丙基，异丙基，正丁基，异丁基，叔丁基，正戊基，环戊基，异戊基和新戊基。用于此处时，“卤素”指F，Cl，Br或I。用于此处时，“烷酰基”可与“酰基”互换使用，指具有大约1至大约10个碳原子的任选取代的直链或分支的脂肪族无环残基(以及其中碳原子范围和具体数目的所有组合和亚组合)，优选大约1个至大约7个碳原子。烷酰基包括但不局限于甲酰基，乙酰基，丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基，2-甲基-丁酰基，2，2- 二甲基丙酰基，己酰基，庚酰基，辛酰基等等。术语“低级烷酰基”指具有大约1至大约5个碳原子的任选取代的直链或分支的脂肪族无环残基(以及其中碳原子范围和具体数目的所有组合和亚组合)。低级烷酰基包括但不局限于甲酰基，乙酰基，正丙酰基，异丙酰基，丁酰基，异丁酰基，戊酰基，异戊酰基等等。用于此处时，“芳基”指具有大约5至大约14个碳原子的任选取代的单环或双环芳香族环系(以及其中碳原子范围和具体数目的所有组合和亚组合)，优选大约6个至大约 10个碳原子。非限制性的例子包括例如苯基和萘基。用于此处时，“芳烷基”指含芳基取代基并且具有约6个至约20个碳原子的烷基 (以及其中碳原子范围和特定数目的所有组合和亚组合)，优选大约6个至大约12个碳原子。芳烷基可被任选的取代。非限制性例子包括例如苯甲基，萘基甲基，二苯甲基，三苯甲基，苯乙基禾口二苯乙基。用于此处时，术语“烷氧(alkoxy)”和“烷氧基(alkoxyl) ”指任选取代的烷基-0-基团，其中烷基如先前所定义的。代表性的烷氧和烷氧基基团包括甲氧基，乙氧基， 正丙氧基，异丙氧基，正丁氧基和庚氧基等等。用于此处时，“羧基”指-C ( = 0) OH基团。用于此处时，“烷氧羰基”指_C( = 0)0-烷基，其中烷基如先前所定义的。用于此处时，“芳酰基”指_C( = 0)-芳基，其中芳基如先前所定义的。代表性的芳酰基包括苯甲酰基和萘甲酰基。通常，被取代的化学部分包括在分子上选定位置处替代氢的一个或多个取代基。 代表性的取代基包括例如卤素、烷基、环烷基、芳烷基、芳基、巯基、羟基(-0H)、烷氧基、氰基 (-CN)、羧基(-C00H)、酰基(烷酰基:-C( = 0)R) ；-C( = 0)0-烷基，氨基羰基(-C ( = 0) NH2), -N-取代的氨基羰基(_C( = 0) NHR"), CF3, CF2CF3等等。关于前述取代基，每一部分 R’’可以独立的是例如H、烷基、环烷基、芳基或芳烷基中的任一个。用于此处时，“L-氨基酸”指通常存在于蛋白质中的任何天然左旋α -氨基酸或那些α-氨基酸的烷基酯。术语“D-氨基酸”指右旋α-氨基酸。除非另外指定，否则本文所提及的所有氨基酸均为L-氨基酸。“疏水”或“非极性”在此同义使用，指不以偶极为特征的任何分子间或分子内相互作用。"PEG化”指其中至少一个聚乙二醇(PEG)部分(无论其大小如何)性地化学附着于蛋白质或肽上而形成PEG-肽缀合物的反应。“PEG化”意味着至少一个PEG部分无论其大小如何被化学性地附着于肽或蛋白质上。术语PEG通常伴随着指示该PEG聚合物的近似平均分子量的数字后缀；例如，PEG-8, 000指具有平均分子量约8，000的聚乙二醇。用于此处时，“药用可接受盐”指所述已公开化合物的衍生物，其中通过制造其酸或碱盐而修饰母体化合物。药用可接受盐的例子包括但不局限于碱性残基诸如胺之无机物或有机酸盐；酸性残基诸如羧酸的碱性盐或有机盐；等等。因此，术语“酸加成盐”指已通过添加酸而制备的母体化合物之相应盐衍生物。药用可接受盐包括自例如无机酸或有机酸形成的母体化合物之常规盐或季铵盐。例如，这样的常规盐包括但不局限衍生自无机酸的那些盐，所述无机酸诸如盐酸，氢溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸，硝酸等等；以及制备自有机酸的盐，所述有机酸诸如乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸， 抗坏血酸，扑酸(pamoic)，马来酸，羟基马来酸，苯基乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，磺胺酸， 2-乙酰氧基苯甲酸，延胡索酸，甲苯磺酸(toluenesulfonic)，甲磺酸，乙烷二磺酸，草酸， 羟乙磺酸等等。本发明的某些酸性或碱性化合物可作为两性离子存在。所述化合物的所有形式，包括游离酸、游离碱和两性离子形式，均涵盖在本发明的范围内。具体描述依照本发明，已将补体抑素结合C3之生物学和物理化学特性的有关信息应用于设计较母体补体抑素肽而言具有显著提高活性的经修饰补体抑素肽。在有些实施方案中， 所述类似物具有比补体抑素至少高300倍的活性。在其它实施方案中，当利用实施例中所述检验进行比较时，所述类似物具有比补体抑素高350-，400-, 450-, 500-, 550-, 600-倍或更多倍的活性。依照先前方法合成的补体抑素类似物已显示出具有较母体肽而言提高的活性， 即高达约99倍(Mallik, B. et al，2005，见前文；W02004/(^6328)，以及高达约洸4-倍 (Katragadda et al.，2006，见前文；W02007/062M9)。依照本发明生产的类似物经由在以前未利用过的补体抑素位置处的修饰显示有提高的活性，并且可使补体抑素或任何当前所述的类似物具有提高的活性。正如附图及本文实施例中所显示的体外检验所证实的，本发明的类似物由此具有比母本肽或迄今为止已生产的其类似物更高的活性。下表显示了具有较补体抑素(Ic[CWQDWGHHRC]T ;SEQ ID N0:1)显著提高之活性的选定代表性类似物的氨基酸序列和补体抑制活性。所述选定类似物依照相比于W02007/062249 中所述的有效补体抑素类似物之(Ac-Ic [CV (1^eW) QDWGAHRC] T-NH2, SEQ ID NO :4，在实施例1中又称为肽14)在指定位置(1-13)处的特定修饰来表示。SEQ ID NOS 5和7-11的肽(在实施例1中又称为肽15和17-21)是依照本发明进行修饰的代表，产生了显著更有效的补体抑素类似物。代表性补体抑素类似物，IC50,以及相对于SEQ ID NO 4 (Ac-Ic [CV(1^eW) QDffGAHRClT-NH2)，IC50 为 206nM)的活性倍数改变
本发明公开了包含能结合C3蛋白并抑制补体激活的肽的化合物。这些化合物与目前可获得的化合物相比展示了大大提高的补体激活抑制活性。所述化合物包含在第8位(甘氨酸)处具有受约束的骨架并且任选的在第13位对苏氨酸的特异取代的补体抑素类似物。