专利名称：用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的rna的制作方法用于蛋白质表达的具有未修饰和修饰核苷酸的组合的RNA本发明涉及多核糖核苷酸，特别是信使RNA，其包含未修饰和修饰核苷酸的组合，用于蛋白质表达和这种RNA用于治疗疾病和诊断程序的应用。信使RNA(mRNA)是聚合体，其由主要以腺苷、胞苷、尿苷和鸟苷作为核苷的磷酸核苷结构単元而构建，其作为中间载体将遗传信息从细胞核中的DNA引入细胞质中，在此其被翻译为蛋白质。因此其适于作为基因表达的替代物。细胞中生物化学过程的说明和人类基因组的说明已掲示缺陷型基因与疾病之间的联系。因此通过基因治疗治愈由缺陷型基因引起的疾病的愿望由来已久。预期很高，但对此的尝试却常常失败。第一个基因治疗方法包括将缺陷型或缺损型基因的完整DNA在载体中引入细胞核，从而实现完整基因的表达，因此提供缺失或缺损型蛋白质。这些尝试常常不成功，并且不太成功的尝试伴有明显的副作用，特别是肿瘤发生提高。 此外，存在由于蛋白质缺少或蛋白质缺陷引起的疾病，而其不可归因于遗传缺陷。在这种情况下，还对通过给予DNA在体内生成相关蛋白质给予考虑。在代谢中产生影响并由于病理学或非病理学原因被破坏或抑制的因子的提供也可被零或低副作用的核酸治疗而影响。mRNA对于治疗遗传性疾病从而治疗导致疾病的基因缺陷的应用也已被提出。其中的优势是mRNA仅必须被引入细胞的细胞质，而不必被插入细胞核中。插入细胞核非常困难和低效；此外，如果载体或其部分被整合到基因组中，则被改变的染色体DNA存在相当的风险。同然，可显示体外转录的信使RNA事实上可在哺乳动物的组织中得到表达，但在利用mRNA治疗疾病的尝试中产生了进ー步的障碍。mRNA稳定性的缺乏具有哺乳动物组织中所需蛋白质不能被以足量利用的影响。进ー步明显的劣势源于mRNA引起相当的免疫学反应的事实。假设这些强烈的免疫反应通过结合Toll型受体如TLR3、TLR7、TLR8和解旋酶RIG-I而产生。为防止免疫学反应，WO 2007/024708提出利用其中四分之一的核糖核苷酸被修饰核苷酸取代的RNA。特别是，考察了在尿苷完全被假尿苷取代时mRNA如何行为。发现这种RNA分子具有明显减少的免疫原性。但是，这些产物的生物学活性还不足以进行成功的治疗。此外，发现其中两种或更多种类型的核苷酸完全被修饰替代的RNA序列很难制成或根本无法制成。为能够为身体提供必要的或有益的蛋白质和/或提供核酸以治疗由于缺失的或缺陷型蛋白质引起的疾病，需要具有可转染细胞的可利用的核酸，其在细胞中足够长时间地保持稳定并提供足量的蛋白质，从而避免过度频繁的施药。但是同时，这种核酸必须不导致明显程度的免疫学反应。因此本发明的目的是提供这样的剂其适用于治疗缺陷型或缺损型基因引起的疾病或缺失或缺损型蛋白质引起的疾病；或可体内产生必要的或有益的蛋白质，其引起显著減少的免疫应答或不引起免疫应答，在生理环境中稳定，即在给予后不立即降解，并且总体上适于作为治疗剂。进一歩，本发明的目的是提供这样的剂用于治疗可被蛋白质的体内生成积极影响的疾病。该问题由权利要求I限定的多核糖核苷酸解決。特别适合的是mRNA，其编码蛋白质或蛋白质片段，所述蛋白质或蛋白质片段的缺陷或缺失不利于身体或其表达有利于身体。当下文使用术语“多核糖核苷酸”或“ mRNA”时，除非上下文另外陈述，应始终假定其为编码与疾病或缺失有关的蛋白质或蛋白质片段——如上所述——或编码有益或支持身体的蛋白质或蛋白质片段的多核糖核苷酸或mRNA。已令人惊讶地发现，如果应用既包含未修饰核苷酸也包含修饰核苷酸的RNA，上述问题可由核糖核酸或多核糖核苷酸(下文也一般被称为RNA)解決，特别是由信使RNA(mRNA)解决，重要的是，预定含量的尿苷和胞苷核苷酸分别以修饰形式存在。进ー步，已令人惊讶地观察到，其中两种类型的核苷酸分别部分被修饰核苷酸替代的RNA显示高翻译和转染效力，即RNA比已知RNA所可能的转染更多的细胞，并且每个细胞产生更多的编码蛋白质。此外，根据本发明修饰的RNA比由本领域状态已知的RNA或未修饰的RNA的活性更长。 根据本发明所述的RNA实现的优势未修饰和完全修饰的RNA均不可得到。已发现，如果mRNA中修饰尿苷和胞苷核苷酸的含量均被具体限定并且为至少5%和不高于50%，可实现免疫-原性减少以及稳定性増加。如果应用无修饰的mRNA，其极具免疫原性，而当全部尿苷和胞苷核苷酸均以修饰形式存在吋，生物学活性对于以治疗为目的的应用过低，而不具备可能性。其中修饰核苷酸的含量极高的RNA可在非常艰难的条件下生成或根本不能生成。因此，已确定，仅包含替代尿苷的假尿苷和仅包含修饰胞嘧啶和/或修饰腺苷的核苷酸混合物不能生成任何RNA序列。但是令人惊讶地，根据本发明所述的方式修饰的RNA序列可被容易地生成，并具有合理的效カ。此外，已发现，修饰的性质至关重要。根据本发明修饰的mRNA显示低免疫原性，并具有长寿命。已发现，根据本发明所述的RNA的稳定性与之前应用的核酸相比得到显著提高。因此，已确定，根据本发明所述的mRNA在转染后10天可被检测到比未修饰的RNA高10倍的量。増加的寿命以及高转染率首先使根据本发明所述的mRNA能用于治疗目的，因为高稳定性和由此而来的长寿命使其能够在较长的时间间隔下完成给药，因此其也可被患者接受。因此，根据本发明，提供了用于治疗目的的特别有利的剂。根据本发明所述的RNA满足如下需要被置于治疗所用的产物上作为RNA其仅需被引入细胞质，无需被引入细胞核以发挥其活性，整合到基因组中的危险不存在，根据本发明所述的修饰类型很大程度地防止免疫反应，此外修饰防止RNA迅速降解。因此用根据本发明所述的RNA能够在组织中产生或重新产生生理学功能，例如恢复已经由于缺陷型或缺损型基因而丧失的体内功能，从而治疗缺陷型或缺损型基因引起的疾病。进一歩，已令人惊讶地发现，根据本发明所述的多核糖核苷酸可有利地影响疾病，原因是蛋白质在体内生成，其可直接或间接对病程造成影响。因此，根据本发明，也可提供这样的多核糖核苷酸其编码在总体情况或具体情况下有益于和支持身体的因子，例如生长因子、血管发生因子、刺激因子、诱导因子、酶或其他生物活性分子。以下描述和附图对本发明进行更详细的说明。图I显示不同核苷酸修饰对不同mRNA的免疫原性和稳定性的影响。图IA是对给予具有不同修饰核苷酸的各种RNA后的TNF- α水平作图的图。未修饰和高达25%单修饰的RNA导致这种RNA的高炎性标记水平，并显示高免疫原性，而对于根据本发明双修饰的RNA，炎性标记以可耐受量存在。图IB和IC显示人类细胞和小鼠细胞中以多种方式修饰的mRNA的生物学活性(转染效カ和表达)，为红色荧光蛋白质(RFP)的阳性细胞的百分率和每个细胞的RFP量。该图显示，未修饰、单修饰和完全修饰的RNA编码的蛋白质仅可被检测到较低的百分含量，而根据本发明部分双修饰的RNA由于其较高的稳定性生成明显较高的蛋白质量。图2显示多修饰(multiply modified)mRNA较高的稳定性和较长的表达持续时间。图2A和2B分别显示对不同的修饰和未修饰mRNA的表达持续时间作图的图。图2C显示未修饰RNA、单修饰(singly modified) RNA和多修饰RNA的RNA免疫沉淀数据。图2D显示对体内静脉内给药后不同mRNA的免疫原性作图的图。数据显示，根据本发明双修饰的RNA呈现高稳定性和低免疫原性的组合。图3显示SP-B条件性缺陷型小鼠的中的修饰SP-B mRNA的气管内气溶胶应用后得到的多个测试結果。图3A显示用未修饰RNA和多修饰RNA治疗的小鼠的肺的生物发光 图像。明显可见的是，5天后仅根据本发明修饰的RNA仍表达足量的蛋白质，而未修饰RNA的表达在3小时后就已经很低。图3B显示将通量相对于转染后时间作图的图。明显可见，根据本发明所述的修饰延长了表达持续时间。图3C显示SP-B mRNA的用药计划。图3D显示呈现将用修饰mRNA治疗的小鼠与用对照mRNA治疗的小鼠的存活率进行比较的图，用根据本发明所述的RNA治疗的小鼠的存活率显著更长。图3E显示免疫染色，其中可见用根据本发明所述的编码SP-B的RNA可重建SP-B缺陷型小鼠的SP-B。图3F显示，由半定量蛋白质印迹分析得到的在无细胞BALF上清液中的蛋白质分布。图3G和H显示根据3C治疗的小鼠的肺组织学制备物和支气管肺泡灌洗制备物的图像。当已接受对照RNA的小鼠的肺和灌洗制备物显示SP-B缺陷常见的肺损伤时，用根据本发明所述的RNA治疗的小鼠的制备物无病理。图31显示关于肺随时间的耐受性的图。在根据本发明所述的RNA的治疗下，肺功能保持较长的时间，而在用对照RNA治疗的动物中发现肺损伤。图4显示将未修饰和不同修饰的mRNA产生的RFP的荧光强度相对于时间作图的图。与未修饰mRNA相比，修饰mRNA较晚被翻译并且强度较弱。图5显示对用不同mRNA治疗的小鼠的炎性标记作图的三个图。明显可见,根据本发明修饰的RNA不导致炎性反应，而未修饰RNA导致强烈的免疫反应。图6显示对用根据本发明所述的不同mRNA治疗的小鼠的不同典型肺參数作图的图。该參数为组织弾性(HL)、组织阻尼(GL)、组织惯性、呼吸道阻力(Rn)和肺组织组成Eta(GL/HL)。对于根据本发明所述的RNA，没有參数比阳性对照组更差。图7在图中显示不同修饰mRNA的表达能力，在该图中对具有不同含量的修饰核苷酸的mRNA的RFP阳性细胞的百分含量作图。比较显示，仅根据本发明修饰的mRNA在人类细胞以及及同样在小鼠细胞中均导致持久表达，而非根据本发明修饰的mRNA以较低的程度表达。图8在图中显示不同修饰mRNA的表达能力，在该图中对具有不同修饰核苷酸的mRNA的RFP阳性细胞的百分含量作图。比较显示，仅根据本发明修饰的mRNA在人类细胞以及同样在小鼠细胞中均导致持久表达，而非根据本发明修饰的mRNA以较低的程度表达。图9显示冻干的根据本发明所述的RNA的稳定性。图IOA显示对不同修饰核苷酸的转染效力作图的图。明显可见，其中10%尿苷核苷酸和10%胞苷核苷酸以及任选地5%进ー步核苷酸被修饰的RNA实现最高的转染效力。图IOB显示对具有不同修饰核苷酸的RNA的TNF-α生成——作为免疫学反应标记——作图的图。这些是各自用SygmRNA转染的人类PBMC的ELISA結果。除非另外说明，修饰率各自为10%。明显可见，其中5至50%之间的尿苷核苷酸和胞苷核苷酸修饰的RNA与未修饰的RNA相比具有明显降低的免疫原性。图11显示多个测试的結果，由其測定根据本发明修饰的编码EPO的mRNA的稳定性和免疫原性。图11 (a)显示在给予以不同方式修饰的编码EPO的mRNA后14天可检测到的促红细胞生成素含量。明显可见，14天后注入根据本发明修饰的mRNA的小鼠中的EPO含 量比未治疗的小鼠高4. 8倍，但也比用未修饰的RNA治疗的小鼠高4. 8倍，并且仍比用单修饰的RNA治疗的小鼠高2. 5倍。 图11 (b)显示在给予具有不同修饰的编码EPO的mRNA后14天和28天的红细胞压积值。该图清楚显示，用根据本发明修饰的mRNA治疗的小鼠具有的明显较高的红细胞压积值。在图11(c)的图中，对免疫学反应的一般性因子的生成作图。发现在给予未修饰mRNA下所有四种炎性标记全部提高，而在给予根据本发明修饰的RNA下免疫学反应几乎不可检测到。图11 (d)的图显示IFN-α和IL-12的相应值，其也是炎性标记。在此同样发现根据本发明修饰的mRNA实际上不引起免疫学反应，与未修饰mRNA形成对比。图12显示对在一周两次给予根据本发明修饰的SP-B mRNA (B)或在28天一周两次给予根据本发明修饰的SP-B mRNA (C)或在对照组给予修饰EGFPLucmRNA (A)的三组小鼠的存活率作图的图。发现只有小鼠被给予SP-B mRNA(BX)才能存活。不提供SP-B mRNA,则小鼠死亡(A)。图13显示给予未修饰的SP-B mRNA、根据本发明修饰的SP-B mRNA或SP-B质粒DNA后8小时小鼠支气管肺泡灌洗的细胞因子水平。结果显示，与气管内给予未修饰的mRNA或质粒DNA——各自导致炎性标记IFN Y和IL-12显著增加——相反，在给予根据本发明修饰的SP-B mRNA下，炎性标记与未治疗的组或全氟碳治疗组相比实际上没有増加。图14显示在重复给予根据本发明修饰的mEPO mRNA后得到的红细胞压积值。结果显示，重复给予根据本发明修饰的mEPO mRNA被良好地耐受，并且造成红细胞压积持久升闻。图15显示与钛植入体温育的细胞的荧光素酶表达，该钛植入体被提供有包含不同形式的根据本发明修饰的RNA的涂层。发现根据本发明修饰的RNA——其被包含在已施加于钛板上的延迟释放的聚合物涂层中并且逐渐自其释放——没有丧失其活性。图16显示施加于钛植入体上、包含修饰mRNA的涂层的荧光素酶表达。发现根据本发明修饰的mRNA的蛋白质表达与未处理的RNA相比大幅提高，但也高于质粒DNA。图17A和17B分别显示具有微RNA 142_3p的微RNA结合位点的mRNA的RFP-阳性细胞的相对含量和相对RFP表达。发现具有微RNA结合位点的RNARFP-阳性细胞的含量较低，并且包含相应微RNA 142-3p的细胞中的编码蛋白质的表达明显较低。图18显示通过并入编码RFP的微RNA结合位点修饰的RNA的序列。以灰色背景显示RFP序列。带有间隔序列(无背景)的微RNA 142-3p的微RNA结合位点的四倍串联重复(浅灰色背景)具有下划线。根据本发明，提供了具有部分多修饰核苷酸、部分多修饰mRNA、IVT mRNA的多核糖核苷酸分子和该RNA分子用于生成治疗由于缺陷型或缺损型基因引起的疾病或治疗通过 体内提供蛋白质如因子、刺激因子、诱导因子或酶缓解或治愈的疾病的药物的应用。在进ー步的实施方式中，将根据本发明所述的mRNA与靶结合位点、靶向序列和/或与微RNA结合位点结合，从而使所需mRNA的活性仅存在于相关的细胞中。在进ー步的实施方式中，将根据本发明所述的RNA与微RNA或shRNA下游的3，聚A尾部结合。在进ー步的实施方式中，提供了其作用持续时间已通过进ー步特定修饰被调节或延长的RNA。因此，本发明的主题是稳定性提高并且免疫原性降低的RNA。根据本发明所述的RNA可以本身已知的方式制成。通常，其通过转录编码完整或所需的可对疾病或其中的引发疾病的缺失或缺陷形式产生影响的蛋白质的DNA而制成。在本发明的上下文中，应理解RNA意为如下任何多核糖核苷酸分子如果其进入细胞，则适于蛋白质或其片段表达；或可被翻译为蛋白质或其片段。术语“蛋白质”在此包括任何种类的氨基酸序列——即各自通过肽键连接的两种或更多种氨基酸的链，也包括肽和融合蛋白质。根据本发明所述的RNA包含编码如下蛋白质或其片段的核糖核苷酸序列所述蛋白质或其片段在细胞中或细胞周围的功能是需要或有益的，例如这样的蛋白质，其缺失或缺损型形式引起疾病或病症、其的提供可缓解或预防疾病或病症或其可在细胞中或细胞周围促进有益于身体的过程。通常，根据本发明所述的RNA包含完整蛋白质或其功能性变体的序列。进ー步，核糖核苷酸序列可编码充当因子，诱导因子、调节因子、刺激因子或酶的蛋白质或其功能性片段，其中该蛋白质是其功能为治疗疾病——特别是代谢疾病——或为启动体内过程如新血管、组织等的形成所必需的蛋白质。在此，功能性变体被理解意为在细胞中可承担如下蛋白质的功能的片段其在细胞中的功能是被需要的或其缺失或缺损型形式是致病的。此外，根据本发明所述的RNA还可具有进ー步的功能区和/或3’或5’非编码区。3’和/或5’非编码区可以是天然地在编码蛋白质或其他有助于RNA稳定的人造序列的侧翼的区域。本领域技术人员通过常规实验可发现在各种情况下对此适合的序列。在优选的实施方式中，RNA包含m7GpppG帽、内部核糖体进入位点(IRES)和/或3’末端的多A尾部，特别是从而提高翻译。RNA可具有促进翻译的进ー步区域。根据本发明所述的RNA的关键是其修饰核苷酸的含量。根据本发明所述的稳定性提高和免疫原性降低的RNA通过将其中修饰胞苷核苷酸和修饰尿苷核苷酸的含量被设定的核苷酸混合物用于其生产而得到。根据本发明所述的RNA优选地用包含未修饰以及修饰核苷酸的核苷酸混合物生产，其中5至50%的胞苷核苷酸和5至50%的尿苷核苷酸被修饰。包含腺苷和鸟苷的核苷酸可未被修饰。也可应用其中ATP和/或GTP中的一些也被修饰的核苷酸混合物，其中其含量应不超过20%，并且其中其含量——如存在——应优选在O. 5至10%的范围内。因此，在优选的实施方式中，提供了具有5至50%修饰胞苷核苷酸和5至50%尿苷核苷酸和50至95 %未修饰胞苷核苷酸和50至95 %未修饰尿苷核苷酸的mRNA，并且腺苷和鸟苷核苷酸可以是未修饰的或部分修饰的，并且它们优选以未修饰形式存在。优选10至35%的胞苷和尿苷核苷酸是修饰的，特别优选修饰胞苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范围内并且修饰尿苷核苷酸的含量在7. 5至25%的范围内。已发现，事实上，相对低的含量，例如分别仅10 %的修饰胞苷和尿苷核苷酸，在其为根据本发明所述的修饰的先决条件下可实现所需性质。核苷修饰的本质对mRNA的稳定性从而寿命和生物学活性具有影响。适当的修饰在下表中显不 本发明涉及具有编码蛋白质或蛋白质片段的序列的多核糖核苷酸，其中该多核糖核苷酸包含未修饰和修饰核苷酸的组合，其中5至50％的尿苷核苷酸和5至50％的胞苷核苷酸为修饰的尿苷核苷酸和修饰的胞苷核苷酸。