专利名称：细菌的保护的制作方法图1显示了暴露于不同种类的胁迫10分钟后，来自于长双歧杆菌NCC481和青春双歧杆菌NCC251细胞RNA的点杂交结果。NCC481和NCC251分别用特异性探针GSR8和GSR5进行杂交。图2显示了在对数期经不同前诱导后，青春双歧杆菌NCC251在55℃的存活图。在MRS和半胱氨酸中，37℃下培养细胞至OD600为0.4～0.7。细胞被分为几等份并使之分别经受47℃处理15分钟、45℃处理30分钟、或1.5％或2％NaCl处理1小时；对照维持在37℃。样品被转移至55℃并在10分钟和20分钟后测定存活细胞数。图3显示了经3和4次反复冻融后青春双歧杆菌NCC251的存活图。取稳定期细胞并使之经受2％NaCl处理1小时，对照不加盐。样品被转移至-80℃并在室温融化。在测定存活细胞数之前，这种循环被重复3～4次。图4显示了在对数期致死胆汁盐条件下长双歧杆菌NCC481的存活图。细胞培养至OD600(在600nm处的光密度)为0.4～0.7并使之经受0.1％牛胆汁处理30分钟。对照不加牛胆汁。样品被分成几等份并转移至0.2％、0.25％和0.3％的牛胆汁处理30分钟，并测定存活细胞数。图5显示了在稳定期致死胆汁盐条件下长双歧杆菌NCC481的存活图。细胞经0.05％牛胆汁处理30分钟。对照不加牛胆汁。样品被分成几等份并转移至0.075％、0.1％和0.15％的胆汁处理30分钟，并测定存活细胞数。图6显示了在对数期致死胆汁盐条件下青春双歧杆菌NCC251的存活图。细胞培养至OD600(在600nm处的光密度)为0.4～0.7并使之经受0.1％牛胆汁处理30分钟。对照不加任何牛胆汁。样品被分成几等份并转移至0.3％和0.4％的牛胆汁处理30分钟，并测定存活细胞数。图7显示了在稳定期致死胆汁盐条件下青春双歧杆菌NCC251的存活图。细胞经受0.1％牛胆汁处理30分钟。对照不加任何牛胆汁。样品被分成几等份并转移至0.15％的牛胆汁处理30分钟，并测定存活细胞数。图8显示了在致死温度条件下约氏乳杆菌Lal的存活图。在MRS中，37℃下培养细胞至OD600(在600nm处的光密度)为0.4～0.7。取出样品并使之经受3.5％NaCl或48℃处理15分钟。对照维持在37℃。然后样品被转移至55℃并在30和60分钟后测定存活细胞数。
图9显示了在生长周期的稳定期在致死温度条件下约氏乳杆菌Lal的存活图。取出样品并使之经受3.5％NaCl或48℃处理15分钟。对照维持在37℃。然后样品被转移至55℃并在60分钟后测定存活细胞数。
菌株及生长条件在补充有0.5g/l半胱氨酸的MRS培养基中，37℃、厌氧条件下(98％N2和2％H2)培养青春双歧杆菌NCC251，长双歧杆菌NCC481，长双歧杆菌NCC490，长双歧杆菌NCC585，和短双歧杆菌NCC298。在MRS培养基中，30℃培养乳酸乳球菌MG1363。在Laria-Bertani培养基中，37℃培养大肠杆菌TG1(Amersham)。在MRS中，37℃培养约氏乳杆菌Lal。
胁迫处理细胞培养至OD600(在600nm处的光密度)为0.4～0.7或在稳定期取出并使之经受不同时间不同胁迫条件的处理。用于冻融试验的细胞在使之经受-80℃处理之前被浓缩于盐溶液中。通过向样品中加入NaCl来实施盐胁迫，而OXGALL(商标)(Difco)被用于胆汁盐胁迫。
双歧杆菌的胁迫处理在厌氧条件下进行，而存活细胞数的测定在好氧条件下进行。在微好氧条件下培养乳杆菌，在好氧条件下进行胁迫处理和存活细胞数测定。
双歧杆菌诱导及致死刺激的范围前诱导致死刺激pH(如HCl)pH6.0-3.5 pH2.5-2胆汁(如牛胆汁) 0.01％-0.1％0.075％-0.4％温度 37℃-48℃ 50℃-60℃盐(如NaCl) 0.5％-3％ 3％-8％前诱导及致死刺激的时间可根据菌株和胁迫条件在5分钟-2小时间变化。
乳杆菌诱导及致死刺激的范围前诱导致死刺激pH(如HCl，乳酸) pH6.0-4.5 pH4.0-2温度 40℃-50℃ 50℃-60℃盐(如NaCl) 0.5％-3.5％4％-8％前诱导及致死刺激的时间可根据菌株和胁迫条件在5分钟-2小时间变化。
DNA技术染色体DNA的提取按照标准方法进行。
mRNA的分析至于斑点杂交，按照标准方法将总RNA提取、变性、转移至无电荷的尼龙膜(GeneScreen，NEN)。膜经预杂交(1小时，40℃)并随后用100pmol地高辛标记的探针(Boehringer)杂交4小时。在含有0.1％SDS的2×SSC中40℃洗膜两次，每次5分钟，并在对应于探针的温度下洗一次，对于两个dnaK特异性探针GSR5(5’-CATCGAAGGTGCCGCCAC-3’)和GSR8(5’-TCGTCACCACCGAGGTG-3’)，温度分别为46℃和48℃，对于通用探针1028R(5’-CCTTCTC CCGAAGTTACGG-3’)，温度为51℃。检测按照操作说明进行。
PCR扩增用简并引物HS1(5’-ATIACIGTICCIGCITA(T/C)TT(T/C)AA(T/C)GA-3’)和HS2(5’-CATIGT(T/C)TCIATICIA(A/G)IGAIA(G/A)IGG-3’)及1μg的染色体DNA作为模板扩增dnaK的核心区域。
扩增在100μl体系(含dATP，dCTP，dGTP及dTTP各200μM，引物各50pmol，2.5单位的Super-TaqDNA聚合酶(HT Biotechnology)，和相应的1×PCR缓冲液)中进行。反应用Perkin-Elmer热循环仪进行在95℃预变性5分钟，接着95℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟循环30次；最后72℃延伸10分钟。
DnaK基因的鉴定在Barril等(1994)的序列比对的基础上，我们选择具有相同氨基酸序列的乳酸乳球菌，大肠杆菌和巨大芽孢杆菌的DnaK的两个区域并设计了两个简并引物HS1和HS2，这两个引物分别对应乳酸乳球菌DnaK的114-122位和366-374位的氨基酸。这一对引物用于以NCC481，NCC490，NCC585，NCC251和NCC298的染色体DNA作为模板的PCR扩增。每个菌株获得两个片段。所有菌株中，大小与两个阳性对照大肠杆菌和巨大芽孢杆菌相对应的片段被从琼脂糖凝胶中分离、纯化并测序。每个片段鉴定出一个开放阅读框，显示了与已知的DnaK蛋白高度的序列相似性。尤其是与链霉菌和蓝细菌及清酒乳杆菌，杆菌和链球菌有高度同一性。
dnaK基因表达的mRNA分析将细胞暴露于热休克和其它通常的胁迫条件下研究dnaK的转录诱导。对数期的长双歧杆菌NCC481和青春双歧杆菌NCC251细胞经受0.1％胆汁盐、1.5％NaCl或42℃和45℃热休克10分钟处理，NCC481和NCC251分别进行了最高温度为47℃和50℃的试验。始终用来自于对数期和稳定期的未诱导细胞作对照。提取总RNA并进行点杂交。DnaK特异性探针GSR8和GRS5分别被用于NCC481和NCC251。通用探针被选用以检查膜上RNA的量和质量。随着处理温度的升高，观察到被处理细胞的dnaK特异性mRNA的浓度随之增加(图1)。与NCC251相反，NCC481的dnaK在进入稳定期时细胞中仅被微弱地诱导。而且在胆汁盐和NaCl处理后，在NCC251中观察到dnaK的微弱的诱导。在同样的条件下在NCC481中没有获得显著的诱导。
存活和交叉保护作用在不同温度、胆汁盐和盐条件下进行约氏乳杆菌Lal，青春双歧杆菌NCC251和长双歧杆菌NCC481的生长和存活试验。
很显然，对数期的NCC251在经过亚致死的热胁迫后，显示出对一般致死的温度55℃的更强抗性。在热休克10分钟和20分钟前使细胞经受47℃处理15分钟，热耐受能力分别提高几乎24倍和128倍(图2)。这些数字是值得注意的，因为它们表明细胞的前诱导对保护它们抵抗否则是致死的刺激具有出乎意料的效果。通过1.5％NaCl前处理1小时实现了抗55℃的9倍和15倍的细胞交叉保护。通过45℃前诱导30分钟或2％NaCl前诱导1小时，相等的抗热胁迫的保护作用也被观察到(图2)。
约氏乳杆菌Lal的处于生长周期对数期的细胞被用3.5％NaCl预处理或48℃预处理15分钟后，显示了抗55℃30分钟400倍高的保护作用。在55℃1小时后，用3.5％NaCl预处理或48℃预处理15分钟的样品，分别观察到抗55℃的10倍和5倍高的保护作用(图8)。
在48℃用3.5％NaCl处理15分钟后，约氏乳杆菌La1的稳定期的细胞显示了抗55℃1小时20倍高的显著的保护作用(图9)。
如果用2％NaCl预胁迫1小时，处于稳定期青春双歧杆菌NCC251的细胞在连续的反复冻融后显示出了14倍高的存活(图3)。在4次反复冻融后，观察到10倍高的存活。
抗致死胆汁盐浓度的保护作用可在青春双歧杆菌NCC251和长双歧杆菌NCC481的对数期及稳定期被观察到。在青春双歧杆菌NCC251的对数期用0.1％的胆汁盐预处理细胞(如30分钟)导致分别抗0.3％和0.4％胆汁盐的300倍和21倍的保护作用(图6)。在0.15％胆汁盐的致死浓度下青春双歧杆菌NCC251(用0.1％胆汁盐前诱导)的稳定期细胞的81倍高的存活被观察到(图7)。从长双歧杆菌NCC481得到了相似的结果。对数期细胞，用0.15％牛胆汁前诱导，显示了分别抗0.2％、0.25％、0.3％牛胆汁的400倍、1800倍及580倍的存活(图4)。当稳定期的细胞被用0.05％的牛胆汁前诱导30分钟时，显示出了抗0.075％、0.1％及0.15％的牛胆汁30分钟的3倍、29倍及150倍的存活(图5)。
与Flahaut等(1996)发表的粪肠球菌细胞抗0.3％胆汁盐的保护作用仅能达到30秒的结果相反，显然细胞能被保护抗致死的胆汁盐浓度30分钟。这是没有预料到的。
长双歧杆菌NCC481，长双歧杆菌NCC490，长双歧杆菌NCC585，青春双歧杆菌NCC251，和短双歧杆菌NCC298的dnaK的核心区域被PCR扩增并鉴定。随后的mRNA分析揭示了在NCC251和NCC481中，dnaK的诱导在转录水平被调控。转录通常被热诱导，而且对于NCC251也被盐和胆汁盐处理诱导。
根据这些结果得出结论双歧杆菌和/或乳杆菌的胁迫预处理能导致在否则是致死的相似的或不同的胁迫条件下显著增加的存活机会。


具有抵抗对非保护细菌细胞是致死的条件的保护作用的细菌细胞,其中受保护的细胞通过使细菌细胞经受亚致死水平的胁迫处理获得。