专利名称：一种检验高产AmpC酶致病菌的纸片和制作及其检验方法 众所周知，抗生素是临床治疗感染性疾病的主要和必要手段，其中以β-内酰胺类抗生素的应用最为广泛。然而致病菌对这类药物的耐药性已成为当前临床抗感染治疗中甚为棘手的一个问题。现代医学研究证明，造成这一问题的主要原因是致病菌代谢产物β-内酰胺酶所致。近年来，随着第三代头孢菌素的广泛应用，以阴沟肠杆菌为代表的大多数革兰氏阴性致病菌，如各种肠杆菌科细菌、不动杆菌、绿脓假单胞菌等代谢中产生的高水平AmpC酶，均导致细菌对除第四代头孢菌素和碳青霉烯类抗生素外的几乎所有β-内酰胺抗生素产生耐药。因此，发明一种简便、快速、准确检出高产AmpC酶致病菌的新技术，对于正确选择抗菌药物，提高临床抗感染治疗效果是一项极为重要的工作，也是一项具有挑战性的工作。目前，用于检验致病菌是否为高产AmpC酶菌株必须结合等电聚焦电泳、酶抑制试验和β-内酰胺酶活性测定等技术，它们通常通过提取受检菌的β-内酰胺酶对AmpC酶进行定量测定。这些方法不仅需要复杂的实验设备，经费开支大，操作繁琐、耗时、费力，而且缺乏统一的技术规范和结果判断标准，几乎不可能在临床推广应用。对此，J Clin Microbiol2000；38(5)1791-1796公开了一种头孢西丁三维试验，其简化了检测程序，检测结果也比较容易判断，但仍需提取受检菌的β-内酰胺酶，技术难度和操作程序仍较大、较繁琐，难以在大多数临床实验室推广应用。《中华检验医学》杂志2002；25(2)88-90公开了一种根据受检菌的常规药敏试验结果推测其是否为高产AmpC酶菌株的方法。但随着致病菌耐药机制的日益复杂化和多样化，特别是由于超广谱β-内酰胺酶的蔓延，这种方法的准确性已越来越不可靠。另外，《中华检验医学》杂志2001；24(4)211-213介绍了一种用双抑制剂扩散协同法检测产AmpC酶致病菌株的技术，但这种方法在检测同时高产AmpC酶又产超广谱β-内酰胺酶菌株时的准确率尚不肯定。
本发明的任务在于提供一种制作容易，价格低廉，易于推广，操作简单，结果可靠的检验高产AmpC酶致病菌的复合纸片。本发明的任务还在于提供一种检验高产AmpC酶致病菌复合纸片的制作方法。本发明的另一任务还在于提供一种用复合纸片检验高产AmpC酶致病菌的方法。本发明的目的是这样实现的。检验高产AmpC酶致病菌的纸片以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成。检验纸片为头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。本发明检验高产AmpC酶致病菌纸片的制作方法，先用灭菌蒸馏水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液后，再取5μl氯唑西林溶液分别加入标准头孢他啶纸片和标准头孢噻肟纸片的中心，即获得头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片，然后将其放于超净台中晾干后，置-20℃冰箱内保存备用。
本发明检验高产AmpC酶致病菌的方法，将标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片和头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，以头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片对同一受检菌株的抑菌环直径值之差和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片对同一受检菌株的抑菌环直径值之差判定受检菌是否为高产AmpC酶菌株。
本发明检验高产AmpC酶致病菌的具体判断标准为头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)，或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)，则判定受检菌为阳性，即受检菌株为高产AmpC酶菌株，否则判定受检菌为阴性，即受检菌为非高产AmpC酶菌株。
为表明本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶菌株检验结果的可靠性，实验室对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准菌株029M、非高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准菌株029和临床分离出的106株阴沟肠杆菌分别进行了检测，结果如下检测结果1。实验室对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M进行检测，结果头孢他啶/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M的抑菌环直径较标准头孢他啶纸片的抑菌环直径增大了6mm，头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对高产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029M的抑菌环直径较标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径也增大了6mm。按以上给出的本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差超过5mm(含5mm)受检菌为阳性的判定标准，受检阴沟肠杆菌标准株029M为高产AmpC酶菌株；头孢他啶/氯唑西林复合纸片对诱导产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029的抑菌环直径较标准头孢他啶纸片的抑菌环直径增大了0mm，头孢噻肟/氯唑西林复合纸片对诱导产AmpC酶阴沟肠杆菌标准株029的抑菌环直径较标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径增大了1mm。按以上给出的本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差小于5mm受检菌为阴性的判定标准，受试诱导产AmpC酶的阴沟肠杆菌标准株029为非高产AmpC酶菌株。
检测结果2。对临床分离出的106株阴沟肠杆菌分别用头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片、标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片进行常规纸片药敏试验，并提取β-内酰胺酶进行头孢西丁三维试验，结果见附表。
从附表可以看出，对临床分离出的106株阴沟肠杆菌，头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片和标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片检验为阳性的有31株，其中12株同时产CTX-M型超广谱β-内酰胺酶，2株同时产SHV-12型超广谱β-内酰胺酶，75株为阴性。其与头孢西丁三维试验的结果也完全一致，符合率为100％。
本发明的优点1、本发明检验高产AmpC酶致病菌的复合纸片结果可靠、经济实用。
2、本发明检验高产AmpC酶致病菌株的复合纸片制作容易，只需将氯唑西林用蒸馏水配制成一定浓度的溶液，再将其分别加入标准头孢他啶和标准头孢噻肟纸片的中心即可制成头孢他啶/氯唑西林复合纸片和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。
3、本发明检验高产AmpC酶致病菌株的复合纸片，使用方法简单，操作容易，只需计算其与相应标准检验纸片的抑菌环直径值之差即可作出准确判断。

本发明头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成。其制作方法是先用灭菌蒸馏水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液，以微量加样器取5μl氯唑西林溶液分别加入30μg/片的标准头孢他啶和标准头孢噻肟纸片的中心，即可制成头孢他啶/氯唑西林复合纸片(30μg/50μg)和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片(30μg/50μg)，再将其放于超净台中晾干后，置-20℃/冰箱中保存备用。
本发明检验高产AmpC酶致病菌株的操作方法及结果判断标准。纸片药敏试验常规操作按NCCLS(美国国家临床实验室标准化委员会)推荐的方法进行。将标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片和头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，常规过夜培养后，测定头孢他啶/氯唑西林复合纸片、头孢噻肟/氯唑西林复合纸片、标准头孢他啶纸片、标准头孢噻肟纸片对同一受检菌株的抑菌环直径。然后分别计算头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差，以及头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差。如果头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差大于5mm(含5mm)，或头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差大于5mm(含5mm)，则受检菌为高产AmpC酶菌株；反之，如果头孢他啶/氯唑西林复合纸片与标准头孢他啶纸片的抑菌环直径值之差小于5mm，而且头孢噻肟/氯唑西林复合纸片与标准头孢噻肟纸片的抑菌环直径值之差也小于5mm，则受检菌为非高产AmpC酶菌株。附表

具有10-40μm长度的变形部分(凹)的数目的标准来评价刀片的磨损。评价刀片磨损所根椐的变形部分的数目是当在每个垂直于纤维层的流向和其平行方向上用切刀切割每个粘合剂层得到的值的平均值。用来切割列为×的粘合剂片材的刀片在图7中所示。
○变形部分的数目为2或更小，刀片磨损很少发生。
△变形部分的数目为3-9；发生刀片磨损的情况。
×变形部分的数目为10或更大，刀片磨损经常发生。
(撕裂性能)从撕裂强度的测量后结果，根椐下列标准评价撕裂性能。撕裂强度是当在每个垂直于纤维层的流向和其平行方向上撕每个剥离衬里得到的值的平均值。
○撕裂强度为0.6N或更大，在剥离时剥离衬里不易于撕裂。
△撕裂强度为0.5N-小于0.6N，在剥离时发生剥离衬里撕裂的情况。
×撕裂强度低于0.5N，在剥离时剥离衬里经常撕裂。
表1

尽管参照具体实施例详细介绍了本发明，但本领域普通技术人员在不脱离本发明的精神和范围内可作各种改变和修改。


本发明公开了一种检验高产AmpC酶致病菌的纸片及其制作和检验方法。其中检验纸片是以氯唑西林为酶抑制剂，以头孢他啶和头孢噻肟为药敏指示剂设计而成的头孢他啶/氯唑西林和头孢噻肟/氯唑西林复合纸片。其制作方法是，先用灭菌生理盐水将氯唑西林配制成浓度为10mg/ml的溶液后，再取5μl氯唑西林溶液分别加入标准头孢他啶纸片和标准头孢噻肟纸片的中心，然后将其放于超净台中晾干后置－20℃冰箱内保存。使用时，将标准纸片和复合纸片分别贴于同一接种好受检菌的MH平皿上，以复合纸片与相应标准纸片的抑菌环直径值之差判定受检菌是否为高产AmpC酶菌株。