专利名称：一种来源于人肺腺癌的细胞株及其制备方法肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织发表的一项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，因此，深入研究肿瘤发生、发展和转移的分子机制，寻找更为有效的肿瘤治疗方案，成为当今医学研究的前沿课题。随着肿瘤生物学研究的不断深入，肿瘤的早期诊断及预防水平有了较大的提高，但是肿瘤治疗后的高转移及高复发仍是肿瘤临床治疗中一个亟待解决的难题。近年来，“肿瘤干细胞”学说的提出及其研究进展，从一个全新的角度去认识肿瘤。该学说认为，肿瘤中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干细胞样亚群并将之称为肿瘤干细胞，这一亚群细胞正是肿瘤的起源细胞并维持肿瘤的生长。因此，肿瘤细胞株是研究细胞癌变机理、肿瘤转移、肿瘤放疗和化疗敏感性分子基础等生物医学问题的重要材料，建立和鉴定不同的肿瘤细胞株是一项很有意义的工作。
本发明的目的是提供一种来源于人肺腺癌的细胞株，所述细胞株具有典型的肿瘤细胞生物学特性；同时，还提供一种所述细胞株的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种来源于人肺腺癌的细胞株，命名为人肺癌细胞株0907，保藏号为CCTCC NO :C201031。所述细胞株在倒置光学相差显微镜下观察，可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，细胞间连接紧密，与平皿之间贴附生长。所述细胞株的体外倍增时间为60. 32证。所述细胞株的蛋白表达特征为VEGF表达阳性。0907的免疫组织化学染色显示其与来源的转移灶肿瘤组织有着相似的蛋白表达，其突出的表达特征为VEGF阳性表达。这是一个血管内皮生长因子，其阳性表达对肿瘤血管的形成和肿瘤生长有着明显的促进作用， 0907可以用来作为一个研究以VEGF作为靶标的靶向药物研究的有力的工具细胞。人肺癌细胞株0907是一株中国南方人肺腺癌细胞系，来源于一位60岁男性肺癌病人的左上肺癌病灶。病人在接受手术前未接受任何化疗，放疗及靶向治疗等治疗。所述来源于人肺腺癌的细胞株，是从病理类型为未分化癌的肺癌病人肺部肿块切除物中培养所得，经病理鉴定为肺未分化癌，为多边形上皮细胞，具有典型的肿瘤细胞生物学特性，它能在体外连续长期传代，在体外制备一年，传100多代，细胞仍然生长增殖活跃。一种来源于人肺腺癌的细胞株的制备方法，包括以下步骤(1)组织块机械解离将切除的人肺腺癌组织解离，清洗去除杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剩余的组织切成组织片，清洗，然后向组织片加入胶原酶，孵育，过滤，然后收集肿瘤细胞，进行接种培养，得到存活细胞；(3)对步骤( 得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法包括以下步骤(1)组织块机械解离将切除的人肺腺癌组织解离，清洗去除粘液和红细胞等杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织；(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剩余的组织切成Imm3的组织片，清洗组织片， 让组织片沉淀，去除上清液，把剩余组织再细切，清洗组织碎片，然后向组织片加入胶原酶， 在37°C下孵育4-18小时；过滤，然后收集肿瘤细胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞；(3)对步骤( 得到的存活细胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中连续培养并传代大于12个月，即得细胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)为将切除的人肺腺癌组织解离成0. 5cm3，用100%的青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全柜，用消毒的PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下，用两个10号注射器针头分离肺癌实质组织，并去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剩余的组织。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤O)为使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)得到的剩余的组织切成Imm3的组织片，用PBS缓冲液清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200单位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小时，通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，然后收集肿瘤细胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮细胞，进行接种培养，得到存活细胞。更优选地，步骤( 中，加入胶原酶的同时还加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高胶原酶对组织的解离效率。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(3)中纯化后的肺癌细胞的培养温度为37°C，气体环境为5% C02/95%空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5 天传代一次。图1为本发明所述细胞株倒置光学相差显微镜GOO倍放大)下生长的活细胞像；图2为本发明所述细胞株种植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤组织的形态图。3. 2细胞流式细胞仪检测细胞周期与凋亡流式细胞仪是美国BECKMAN_COULTER(贝克曼-库尔特)公司生产。机器型号 ELITE，激光波长488nm，功率15丽。取IO6已固定的细胞，用PBS洗两遍，去上清后加入 300 μ 1 DNA染液(内含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20单位/ml)，室温30min。上机激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值< 2%，收集12000个细胞，DNA周期分析用美国ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE 软件，最后计算出细胞各期的百分数。另外，细胞凋亡是用仪器自带软件处理，直接得出细胞的凋亡率。本发明所述人肺癌细胞株09070907的体外倍增时间为60. 32 ！。5、异体动物接种向异体动物体内接种细胞悬液，观察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下进行注射。IO6个本发明所述人肺癌细胞0907种植在5只4周龄的NOD-SCID鼠肩胛部皮下， 第3周种植部位均出现直径约2mm的移植瘤，2个月后瘤体增大到1. 2cm,麻醉后处死动物， 移植瘤组织经包埋切片HE染色形态如图2所示，细胞体积大，核大，核仁明显，与来源的病人组织相似。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。


本发明公开一种来源于人肺腺癌的细胞株，所述细胞株命名为人肺癌细胞株0907，保藏号为CCTCC NOC201031。同时，本发明还公开了所述细胞株的制备方法。