专利名称：一种来源于人肺大细胞癌的细胞株及其制备方法肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一，世界卫生组织发表的ー项研究报告表明，全球癌症状况将日益严重，因此，深入研究肿瘤发生、发展和转移的分子机制，寻找更为有效的肿瘤治疗方案，成为当今医学研究的前沿课题。随着肿瘤生物学研究的不断深入，肿瘤的早期诊断及预防水平有了较大的提高，但是肿瘤治疗后的高转移及高复发仍是肿瘤临床治疗中ー个亟待解决的难题。近年来，“肿瘤干細胞”学说的提出及其研究进展，从ー个全新的角度去认识肿瘤。该学说认为，肿瘤中存在一部分独特的具有自我更新和分化功能的干細胞样亚群并将之称为肿瘤干細胞，这ー亚群細胞正是肿瘤的起源细胞并维持肿瘤的生长。因此，肿瘤細胞株是研究細胞癌变机理、肿瘤转移、肿瘤放疗和化疗敏感性分子基础等生物医学问题的重要材料，建立和鉴定不同的肿瘤细胞株是ー项很有意义的工作。
本发明的目的是提供一种来源于人肺大细胞癌的細胞株，所述细胞株具有典型的肿瘤細胞生物学特性；同时，还提供一种所述細胞株的制备方法。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为一种来源于人肺大细胞癌的細胞株， 命名为人肺癌细胞株1125，保藏号为CCTCC NO :C201(^9。所述细胞株在倒置显微镜下观察，可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，細胞间连接紧密，与平皿之间贴附不紧密，易消化分散，有細胞有悬浮生长倾向。所述细胞株的体外倍増时间为35. 77证。所述细胞株的蛋白表达特征为vimentin、和NSE均表达阳性。本发明的来源于人肺大细胞癌伴神经内分泌分化的細胞株1125是发明人从肺癌病人肺部肿块切除物中培养成功，经病理鉴定为肺大细胞癌伴神经内分泌分化。为上皮细胞，具有典型的肿瘤細胞生物学特性。它能在体外连续长期传代，在体外培养一年，传100 多代，細胞仍然生长增殖活跃。本发明细胞系经检测，其一般生物学特性表明该细胞系为多边形巨細胞，贴壁生长。接触性生长抑制消失。一种来源于人肺大细胞癌的細胞株的制备方法，包括以下步骤(1)组织块机械解离将切除的人肺大细胞癌组织解离，清洗去除杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剰余的组织；(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剰余的组织切成组织片，清洗，然后向组织片加入胶原酶，孵育，过滤，然后收集肿瘤細胞，进行接种培养，得到存活細胞；(3)对步骤( 得到的存活細胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞连续培养并传代大于12个月，即得細胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述制备方法包括以下步骤(1)组织块机械解离将切除的人肺大细胞癌组织解离，清洗去除粘液和红细胞等杂质，分离肺癌实质组织，去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后，得到剰余的组织；(2)胶原酶消化将步骤(1)得到的剰余的组织切成Imm3的组织片，清洗组织片， 让组织片沉淀，去除上清液，把剩余组织再细切，清洗组织碎片，然后向组织片加入胶原酶， 在37°C下孵育4-18小时；过滤，然后收集肿瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮細胞，进行接种培养，得到存活細胞；(3)对步骤( 得到的存活細胞进行纯化，去除纤维细胞等杂质，纯化后的肺癌细胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中连续培养并传代大于12个月，即得細胞株。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)为将切除的人肺大细胞癌组织解离成0. 5cm3，用100%的青-链霉素双抗溶液浸泡移至生物安全拒，用消毒的 PBS缓冲液反复清洗组织去除粘液和红细胞等杂质，再浸泡于培养基中移至解剖显微镜下， 用两个10号注射器针头分离肺癌实质组织，并去除正常肺泡及支气管组织和间质组织后， 得到剰余的组织。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤O)为使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)得到的剰余的组织切成Imm3的组织片，用PBS缓冲液清洗组织片，让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200単位/ml，溶解在PBS中)，在37°C下孵育4_18小吋，通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，然后收集肿瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中悬浮細胞，进行接种培养，得到存活細胞。更优选地，步骤( 中，加入胶原酶的同时还加入有3mM的CaCl2。加入CaCl2可提高胶原酶对组织的解离效率。作为本发明所述制备方法的优选实施方式，步骤(3)中纯化后的肺癌細胞的培养温度为37°C，气体环境为5% C02/95%空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5 天传代一次。图1为本发明所述细胞株倒置光学相差显微镜下GOO倍放大)生长活細胞像；图2为本发明所述细胞株种植在NOD-SCID鼠肩胛部皮下移植瘤组织的形态图。(2)胶原酶消化在解剖显微镜下去除肺癌标本中的间质组织后，使用无菌的解剖刀和剪子把步骤(1)所得的剰余的组织切成Imm3组织片，用PBS缓冲液清洗组织片。让组织片沉淀，去除上清液，用无菌解剖刀和剪子把剩余组织再细切，用PBS清洗组织碎片数次，然后加入胶原酶(50-200単位/ml，溶解在PBS中)，在37°C孵育4_18小时后。在胶乳胶原酶的同时可加入3mM CaCl2，以提高胶原酶对组织的解离效率。通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，以分离分散細胞、组织碎片和较大的碎片；对较大的组织碎片可以加入新鲜的胶原酶进行进ー步的解离。消化完全后，收集肿瘤細胞，在含20%胎牛血清的高糖 DMEM培养基中悬浮細胞，进行接种培养，得到存活細胞；(3)对步骤( 所得存活細胞进行纯化，去除纤维細胞等杂质細胞，纯化后的肺癌細胞在含20%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养，培养温度为37°C，气体环境为5% C02/95%空气，湿度为饱和湿度，每3天更换一次培养液，每5天传代一次，连续培养并传代超过12个月，得細胞株。所述步骤(1)中的肺癌组织，来源于一位59岁女性肺癌病人的左下肺癌病灶。病人在接受手术前未接受任何化疗、放疗及靶向治疗等治疗，术中发现肺部肿瘤位于左下肺， 质地脆软，大量坏死，局部侵润生长，壁胸膜广泛转移。所述步骤(3)中得到的細胞株，于2010年4月1日送达中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO :C201029，命名为人肺癌细胞株1125。实施例2本发明所述人肺癌細胞株1125的检测鉴定UG6PD同エ酶检测物种来源(由中国典型制备物保藏中心检测)。本发明所述人肺癌細胞株1125是ー株伴神经内分泌功能的中国南方人肺大细胞癌系，来源于一位53岁男性肺癌病人的右上肺癌病灶。病人在接受手术前未接受任何化疗、放疗及靶向治疗等治疗。2、形态观察主要观察細胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等，以及細胞骨架微丝微管的排列状态等。2. 1倒置光学显微镜观察主要在正常生长状态下观察細胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、粘附特性寸。倒置光学相差显微镜下观察本发明所述人肺癌細胞株1125，可见细胞体积大，核大，胞浆丰富，細胞间连接紧密，与平皿之间贴附不紧密，易消化分散，有細胞有悬浮生长倾向。如附图1所示。2. 2投射电镜观察(1)从2. 5%戊ニ醛固定液中取出样品，用0. 2mol/L PBS(pH7. 4)漂洗3次，毎次 15min ；(2) 1 % OsO4 后固定，室温 Ih ；(3) 0. 2mol/L PBS (ρΗ7· 4)漂洗 3 次，每次 15min ；(4)50%、70%、90%及100%的丙酮逐级脱水，每梯度浓度15min ；(5)浸透用丙酮树脂=1 1浸lh，然后用丙酮树脂=1 2浸浊最后纯树脂浸过夜；(6)样品包埋后进行聚合，700C，24h ；(7)超薄切片，厚度8Onm ；(8)铅-铀染色后，上机观察。电镜超微结构显示，本发明所述人肺癌細胞株1125細胞有着令人印象深刻的细胞表面长绒毛，細胞间绒毛交缠，连接紧密。核大，核膜边缘分布少许异染色质，細胞器以线粒体和内质网较多，线粒体多为斑马样线粒体。2. 3免疫组化检测细胞标记蛋白采用S-P法进行免疫组化染色，免疫组化染色S-P试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。所用的抗体为CK7、TTF-I、vimentin、EGFR、VEGF和NSE。具体步骤为(1)待检测细胞株提前M小时爬片于消毒载玻片上，24小时后，用PBS缓冲液冲洗2次，冷丙酮固定15分钟，浸泡于PBS中备用；(2)取所需玻片加1滴或50 μ 1过氧化物酶阻断溶液(试剂Α)室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性；PBS冲洗三次，毎次3分钟；(3)除去PBS液，每张切片加1滴或50 μ 1正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟；(4)除去血清，每张切片加1滴或50 μ 1的第一抗体，室温下孵育60分钟；(5) PBS冲洗三次，毎次3-5分钟；除去PBS液，每张切片加一滴或50 μ 1生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，毎次3分钟；(6)除去PBS液，每张切片加1滴或50 μ 1链霉菌抗生物素过氧化酶溶液(试剂 D)，室温下孵育10分钟；PBS冲洗三次，毎次3分钟；(7)除去PBS液，每张切片加2滴或100 μ 1新鮮配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟；(8)自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝；(9)DAB显色，切片经过梯度酒精脱水干燥，ニ甲苯透明，中性树胶封固。免疫组化检测结果判断方法按细胞着色评分棕褐色3分；棕黄色2分；淡黄色 1分；无着色0分。同样物镜下计数阳性細胞数，按阳性細胞的数量评分一个视野内着色细胞> 70%为4分；51% -75%为3分；11% -50%为2分；-10%为1分；阴性为0分。 两项得分相乗，满3分为“ + ” ；4分为“++” ；5分以上为“+++”。“+ +++”为阳性表达。本发明所述人肺癌細胞株1125的免疫组织化学染色显示，1125的免疫组织化学染色显示其与来源的转移灶肿瘤组织有着相似的蛋白表达，其突出的表达特征为NSE的阳性表达。1125癌細胞具有神经内分泌功能。1125还同时表达Vimentin，这提示細胞系的转移潜能比较高。3、細胞生长增殖检测細胞生长曲线、細胞分裂指数、倍增时间、細胞周期时间。3. IMTT法測定細胞生长增殖和对药物的敏感性(1)取96孔细胞制备板，每孔中加0. Iml含2 X IO4 10 X IO4靶细胞的制备液(含 10%小牛血清的DMEM制备液)，在37°C 5% C02的饱和水汽ニ氧化碳制备箱中制备2_3小时，让细胞贴壁；(2)用DMEM制备液0. 1 100倍递次配置药物，每孔加0. Iml稀释的药物和待检細胞，每个稀释度3个重复孔。对照孔9个3个阳性对照孔，每孔加0.1ml含1000倍药物的DMEM制备液和細胞，3个阴性对照孔，每孔加不含药物的0. Iml DMEM制备液和細胞， 3个空白对照孔，每孔加0. Iml DMEM制备液，不加細胞。在37°C 5% CO2的饱和水汽ニ氧化碳制备箱中制备M 48小时或预定的时间；(3)吸去制备液，用PBS洗涤一次(如为悬浮細胞，应在吸去上清液前离心制备板)；(4)每孔加0. Iml PBS和10 μ 1 MTT染液，在37°C 5% CO2的饱和水汽ニ氧化碳制备箱中制备4 6小吋；(5)每孔加0. Iml酸化异丙醇，也可用含10% SDS的lOmmol/L HCl代替酸化异丙醇，在振荡器上振荡混勻，让还原产物充分溶解。置酶联检测仪上測定光密度(OD)值，检测波长570nm，參考波长630nm。以OD值对样品稀释度作图，比较标准曲线和待测样品曲线即可求得待测样品中細胞因子的含量。3. 2細胞流式細胞仪检测細胞周期与凋亡流式細胞仪是美国BECKMAN_COULTER(贝克曼-库尔特)公司生产。机器型号 ELITE，激光波长488nm，功率15丽。取IO6已固定的細胞，用PBS洗两遍，去上清后加入 300 μ 1 DNA染液(内含碘化丙啶100 μ g/ml和RNase 20单位/ml)，室温30min。上机激光管预热30min后用荧光微球(美国BECKMAN-COULTER公司)调整仪器，使各放大器接收的信号的HCV值< 2%，收集12000个細胞，DNA周期分析用美国ΡΗΕ0ΝΙΧ公司的MULTYCYCLE 软件，最后计算出細胞各期的百分数。另外，細胞凋亡是用仪器自带软件处理，直接得出细胞的凋亡率。本发明所述人肺癌細胞株1125的体外倍増时间为35. 77 ！。4、細胞核型分析检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。4. 1准备秋水仙碱(秋水仙素)，生理盐水配制成10 μ g/ml浓度，15磅20分钟灭菌，分装，置-20°C;低渗液0. 35% KCl ；固定液(Carnoy固定液)甲醇冰乙酸(3 1)， 临时配制；Giemsa工作液1份原液和10份磷酸缓冲液，临时配制。4. 2秋水仙素处理终止制备前2-4小吋，在制备液中加入秋水仙碱(用Iml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0. 07 μ g/ml)。4. 3染色体制备(1)收集細胞将制备物全部转入洁净离心管中，以IOOOrpm离心8_10分钟，弃上
清液；(2)低渗处理向刻度离心管中加入预温37°C的低渗液8ml，用滴管混勻，置37°C 恒温水浴中低渗15-25分钟；(3)预固定低渗后加入0. 5ml固定液，轻轻混勻后IOOOrpm离心8_10分钟；(4) 一固定弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混勻，静置20分钟；IOOOrpm离心，弃
上清液；(5) ニ固定、三固定同一固定；
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(6)制悬液弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液；(7)滴片吸取細胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干；(8)染色1 =IOGiemsa染色5_10分钟，细水洗去多余染液，气干；(9)镜检低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。5、异体动物接种向异体动物体内接种细胞悬液，观察成瘤能力。采用皮下注射的方法，注射时用左手拇指及食指轻轻捏起皮肤，右手持注射器将针头刺入，固定后在小鼠背部或前肢腋下进行注射。IO6个本发明所述人肺癌細胞株1125細胞种植在5只4周龄的NOD-SCID鼠肩胛部皮下，第3周种植部位均出现直径约2mm的移植瘤，2个月后，瘤体増大到1. 2cm，麻酔后处死动物，移植瘤组织经包埋切片HE染色，形态如附图2所示，細胞体积大，异型性明显，核大，核异型性明显，核仁明显，与来源的病人组织相似。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管參照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。


本发明公开一种来源于人肺大细胞癌的细胞株，所述细胞株命名为人肺癌细胞株1125，保藏号为CCTCC NOC201029。同时，本发明还公开了所述细胞株的制备方法。