专利名称：一种高产延胡索酸米根霉及其应用的制作方法延胡索酸(fumaric acid)是一种重要的二元羧酸，广泛用于树酯合成、食品添加剂、饲料添加剂、医药、航空材料等工业生产中。米根霉(Miizopus delemar)作为大量积累延胡索酸的主要微生物之一，广泛用于有机酸、酶、抗体、低胆固醇的生产。R. delemar胞内存在TCA氧化途径及胞液中TCA还原途径。丙酮酸在丙酮酸羧化酶作用下，与(X)2相互作用形成草酰乙酸。同时，作为TCA氧化途径中间代谢产物的草酰乙酸，在菌体生长过程中作为前体物质用于菌体物质的合成。当微生物生长环境中氮源成为菌体生长的限制条件时， 菌体停止生长，葡萄糖代谢过程中的(X)2固定途径仍然继续作用，此时C4化合物积累。在非菌体生长时期，Imol葡萄糖分解代谢，在丙酮酸羧化酶作用下固定2mol CO2，形成2mol延胡索酸。然而，如果米根霉菌体代谢只有TCA还原途径，则无法合成供物质运输及维持机体正常生理代谢的ATP，因此，延胡索酸合成过程伴随着TCA氧化途径。此外，研究表明米根霉新陈代谢，碳代谢流从丙酮酸节点流向TCA氧化途径的代谢通量远超过流向TCA还原途径。 因此，通过分子改造或者改变培养条件调节碳代谢流向过量积累延胡索酸成为众多研究者探讨的热点。但是，针对米根霉的基因操作技术及遗传改造技术相对薄弱，且米根霉是多核细胞，重组细胞有丝分裂不稳定。因此，针对米根霉外源基因的表达直到近10年才有一点突破，而碳代谢流的细节至今仍不明确。
本发明要解决的技术问题是一种高产延胡索酸米根霉，通过过量表达丙酮酸羧化酶基因，强化胞液中TCA还原途径，增强丙酮酸节点流向胞液中TCA还原途径的碳代谢通量，实现延胡索酸过量积累的方法。所述米根霉(R. delemar)过量表达外源丙酮酸羧化酶基因。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种获得所述米根霉的方法，具体步骤如下1)根据米根霉(R. delemar)胞内蛋白的表达与启动子直接相关，而与拷贝数无关，以NCBI公布的Iihizopus oryzae ΑΜ^846、ΑΜ^847序列设计两对引物分别扩增丙酮酸脱羧酶基因的启动子与终止子片段；2)以NCBI公布的ΝΜ_001180927. 1)序列，采用化学全合成方法合成丙酮酸羧化酶基因编码区；3)将步骤1)和2、得到的三段片段进行融合，形成完整的丙酮酸羧化酶基因表达框；4)将步骤幻获得的表达框克隆到PRS303H载体，转化米根霉悬浮孢子后得到重组菌。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种应用所述米根霉发酵生产延胡索酸的方法，以米根霉为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30°c培养5-7天，至分生孢子成熟； 无菌水洗下孢子，稀释到IO6个/mL ；以4%的体积比转接孢子悬浮液至种子培养基，30°C， 200rpm培养30h ；以10%的体积比转接前培养种子至发酵培养基，30°C，200rpm培养72h。产孢子培养基PDA培养基。种子培养基成分为(g/L):葡萄糖20，大豆蛋白胨6，碳酸钙6。发酵培养基成分为(g/L)葡萄糖80，(NH4)2SO4 2，KH2PO4 0. 3，MgSO4 · 7H20 0. 4， ZnSO4 · 7H20 0. 044，FeSO4 · 7H20 0· 01，CaCO3 80，灭菌后加甲醇 15mL。细胞干重测定基于延胡索酸钙的低溶解度，发酵液沸水浴至澄清后，添加去离子水至无晶体析出，取发酵液20mL，SOOOg离心IOmin收集菌丝体。然后用去离子水冲洗菌丝体3遍，105°C过夜烘干至菌丝体质量恒定，测定菌体质量。葡萄糖、延胡索酸浓度的测定高效液相色谱(HPLC)仪器=Aglient 1200高效液相色谱仪检测器视差择光检测器(refractiveindex detector, RID)；检测波长2IOnm；流动相0.005M H2SO4 ；流速0. 5mL · mirT1 ；柱温35°C;液相柱Bio-I adAminex HPX-87H 离子交换柱。样品制备向发酵液中添加过量的HCl中和发酵液中过量的碳酸钙直至无气泡产生。沸水浴增加延胡索酸的溶解度，至发酵液澄清。基于延胡索酸钙的低溶解度，采用去离子水稀释发酵液直至无延胡索酸晶体析出。收集发酵液样品，备用液相测定。酶活分析4°C，IOOOOg离心IOmin收集菌体，Imol · L—1的KOH溶液清洗菌丝体至浑浊液PH7. 0,去离子水清洗菌丝体3遍，40C，IOOOOg离心IOmin收集菌体，冷冻干燥，保存在液氮中。以1 3的比例悬浮菌丝体于0. OlM Tris-HCl缓冲液(pH7. 5)中，超声波破碎细胞lOmin，14000g离心15min沉淀细胞碎片，收集上清液立即测定酶活。酶活测定反应液包括 Tris-HCl 缓冲液(pH8. 5) lOOmM，丙酮酸钠 5mM，MgCl2 · 6H20 5mM，碳酸氢钠 15mM，ATP 2mM,NADH 0. 15mM，氯化钾10mM。30°C，反应lmin，340nm波长条件下测定吸光度。1单位的酶活定义为单位时间内催化丙酮酸合成1 μ mol草酰乙酸，即氧化1 μ mol NADH所需要的酶量，酶活单位为u/mg protein。本发明以一株能以葡萄糖为唯一碳源，过量积累延胡索酸的R. deIemar NRRL15^为出发菌株，利用代谢工程手段构建一株能过量表达&PYC1基因的重组菌 R. delemar-pRS303H-PC。通过强化丙酮酸羧化途径，加大碳代谢流进入TCA还原途径的代谢通量，促进延胡索酸的过量积累。培养7 后，延胡索酸产量达到55. 92g/L，是出发菌株的119倍。调节微生物细胞内TCA还原途径，促进碳代谢流流向TCA还原途径中间代谢产物，实现代谢产物过量积累的策略，为工业生物技术特别是采用代谢工程手段改造米根霉提高目的产物产量提供了新的技术思路。引物名称引物序列ProPYC 1 FPacI TTAATTAATTTAC AATAAAGTTGATGTCC AACC
ProPYClR CGCTTAAAAGAAACGCTGTAGTTTAGTTCAAATAATATTTTTTTTTGTG TerPYClF TGTTGAAACTAAGGCATGAAGTTCTCTTTCTGTAATAATCCTTGA TerPYClRSalI GTCGACAAGCATTAAAGTAAGACAGC-GATAT_实施例2过量表达&PYC1基因的R. deIemar重组菌的筛选将重组质粒pRS303H-PC纯化后，电转R. delemar NRRL1526 (美国农业研究菌种保藏中心)萌发孢子。将能在PDA+HygB培养基上生长的菌株，转接PDA培养基产孢子培养， 孢子悬浮液涂布PDA+HygB培养基培养皿，如此连续传代3次，得到遗传稳定的重组子。挑取阳性重组子若干提取基因组，利用引物ftOPYCIFPacI、TerPYCIRSalI进行PCR验证，得到长约5. 7kb的片段，并进行DNA测序。测序结果与预期一致，表明PRS303H-PC已成功整合到R. delemar基因组中。所得重组菌命名为R. delemar-pRS303H-PC。该菌在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上生长时，丙酮酸羧化酶活性为4. 59U/mg protein，是出发菌株的5. 4倍。实施例3发酵生产延胡索酸的方法以米根霉R. delemar-pRS303H-PC为出发菌株，接种到产孢子培养基中，30°C培养 5-7天，至分生孢子成熟；无菌水洗下孢子，稀释到IO6个/mL ；以4%的体积比转接孢子悬浮
5液至种子培养基，30°C，200rpm培养30h ；以10%的体积比转接前培养种子至发酵培养基， 30°C，200rpm 培养 72h。 重组菌与对照菌相比(1)对照菌中延胡索酸产量为46. 87g/L，重组菌中延胡索酸产量可达55. 92g/L，是对照菌的1. 19倍；(2)发酵结束后对照菌菌体量为7. 58g/L，重组菌菌体量为7. 41g/L，两者相差无几。


本发明公开了一种高产延胡索酸米根霉及其应用，属于遗传工程领域。本发明采用代谢工程手段，将来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中编码丙酮酸羧化酶的基因ScPYC1过量表达于发酵法生产延胡索酸的菌株Rhizopus delemar NRRL1526中，获得了一株丙酮酸羧化酶活性提高的重组菌R.delemar-pRS303H-PC，其丙酮酸羧化酶活性提高了5.4倍(达到4.59U/mg protein)；以葡萄糖为唯一碳源，发酵72h后，延胡索酸产量达到55.92g/L，是出发菌株的1.19倍，具有广阔的应用前景。