专利名称：一种用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法烟草是一年生草本植物，属于茄科(Solanaceae)烟草属(Nicotiana)，在世界上分布广泛，目前发现的烟草属有66个种。2010年，全国烟草行业实现税利超过6000亿元。烟草黑胫病是烟草生产上最具毁灭性的侵染性病害之一，在我国常年发病率维持在10-15%， 发病面积约76372hm2，造成的年损失产量约观69. ^Kg,经济损失达1. 23亿元人民币以上。 目前的研究表明，土壤中黑胫病病原菌的数量与烟草黑胫病的发生密切相关。因此，检测土壤中烟草黑胫病菌的数量，可以及早进行预防，降低黑胫病的发生。目前常用的土壤中黑胫病菌的检测方法主要是通过菌体培养和普通的PCR方法，这两种方法具有准确性低、费时和重复性差等缺点。而荧光定量PCR(Real time fluorescent quantitative PCR,Real-time Q-PCR)方法是一种灵敏度高、稳定性好、省时的检测技术，并具有自动化的特点，检测结果可在10 1012拷贝范围，在国内外病原微生物的检测中具有广泛的应用。通过该方法对土壤中的烟草黑胫病菌进行荧光定量PCR检测，同时参考标准曲线，可以检测土壤中烟道黑胫病菌的数量，为预防烟草黑胫病的发生提供了前提和保障。
本发明提供了一种用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，旨在解决目前常用的土壤中黑胫病病菌的检测方法主要是通过菌体培养和普通的PCR方法，这两种方法准确性低、费时和重复性差的问题。本发明的目的在于提供一种用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，该方法包括以下步骤该方法包括以下步骤取低温保存的烟草黑胫病病菌和其他真菌进行培养，并利用CTAB法提取基因组 DNA ；提取烟草黑胫病病菌土壤的总DNA ；根据基因库中烟草黑胫病病菌的基因序列设计引物，并进行引物特异性PCR扩增验证；检测、分析引物的灵敏度并制作荧光定量PCR标准曲线；利用荧光定量PCR标准曲线，对不同烟草黑胫病发病程度土壤的DNA进行定量分析。本发明提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，对土壤中烟草黑胫病菌进行 DNA提取以及分子检测，省去了传统的分离培养的方法，在时间上大大缩短了检测周期，整个检测0. 5天即可完成，与普通PCR检测方法相比，无需后续的处理过程，并且能对结果进行实时监测，设计的引物是基于病原菌ITS的易变区域设计的，相近物种扩增时没有相应条带，所得产物的大小为172bp，经与近似菌种扩增验证，特异性好，适于荧光定量PCR反应条件，增加了土壤中总DNA的提取方法，在土壤总DNA提取缓冲液加入了 2%的PVP，有效地去除了土壤中部分杂质的污染，减少了对PCR效果的影响，大大提高了荧光定量PCR的检测灵敏度，同时荧光定量PCR的体系及反应条件根据所设计引物大小摸索条件所得，操作简单，检测灵敏度高，可以达到2fg/ μ 1，土壤中只有一个病原孢子的存在，即可检出。图1是本发明实施例提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法的实现流程图；图2是本发明实施例提供的利用CTAB法提取基因组DNA的实现方法的流程图；图3是本发明实施例提供的提取烟草黑胫病病菌土壤的总DNA的实现方法的流程图。在步骤S205中，低转速离心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用无水乙醇漂洗1次， 吹干，重悬于IOOul双蒸水中，_20°C保存备用。如图3所示，在本发明实施例中，提取烟草黑胫病病菌土壤的总DNA的实现方法为在步骤S301中，制备分生孢子悬浮液并接种土壤，每份土壤3个重复；在步骤S302中，土壤样品中加入DNA提取缓冲液，37°C温浴30min，每5min混勻；在步骤S303中，加入20% SDS，终浓度为2%，65°C水浴浊，每IOmin颠倒混勻， 6000g室温离心IOmin ；在步骤S304中，加入酚、氯仿、异戊醇，三者体积比为25 24 1，12000r/min离心lOmin，上清液中加入氯仿、异戊醇，二者体积比为24 1，12000r/min离心IOmin ；在步骤S305中，取上清，加入2/3倍体积的_20°C预冷异丙醇沉淀，静置约30min ；在步骤S306中，低转速离心，沉淀用70%乙醇漂洗2次，再用无水乙醇漂洗1次， 吹干，重悬于IOOul双蒸水中，_20°C保存备用。在本发明实施例中，DNA提取缓冲液中加入了 2%的PVP，用于去除土壤中部分杂质的污染、减少对PCR效果的影响、提高荧光定量PCR 的检测灵敏度。在本发明实施例中，土壤总DNA提取缓冲液的组成为pH 值为 8.0 的 100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA_Na2，2 % PVP,1. 5mol/L NaCl, 1% CTAB, 125μ g/mL 蛋白酶 K。在本发明实施例中，根据基因库中烟草黑胫病病菌的基因序列设计引物，并进行引物特异性PCR扩增验证的实现方法为根据NCBI数据库中烟草黑胫病病菌的18S rDNA基因序列，利用 Primer5. 0 设计荧光定量 PCR 特异引物 SP 5 ‘ -TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3 ‘ , AP 5，-CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3 ‘，扩增目的片段长度为 172bp ；将提取的烟草黑胫病病原菌基因组DNA和其他致病真菌的基因组DNA进行引物特异性检测。在本发明实施例中，该方法中设计引物特异性好，相近物种扩增时没有相应条带， 所得产物的大小为172bp，适于荧光定量PCR反应条件。在本发明实施例中，该方法中荧光定量PCR的扩增体系及反应条件根据所设计引物大小摸索条件所得，与所设计的引物相适应；其中，荧光定量PCR的扩增体系为IXSYBR Green I Master Mix(TaKaRa) 10 μ 1，引物各为 400nM，模板 2 μ L，扩增体系为25μ L ；荧光定量PCR的反应程序为94°C预变性 5min，94°C变性 20s，65°C退火 40s，72°C延伸 40s, 72°C 5min，40 个循环。在本发明实施例中，检测、分析引物的灵敏度并制作荧光定量PCR标准曲线的实现方法为以接种不同浓度病菌分生孢子的土壤DNA为模板，检验该引物对土壤中分生孢子的灵敏度；以烟草黑胫病病菌基因组DNA的10倍梯度稀释液为模板，检验引物SP/AP对基因组DNA的灵敏度，其检测下限为2fg/y 1基因组DNA，说明该引物具有很高的灵敏度；选取不同稀释梯度的DNA为模板，荧光定量PCR扩增，制作荧光定量PCR标准曲线。下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。如图1所示，本发明实施例提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，其步骤如下(1)真菌培养及基因组DNA提取取低温保存的的烟草黑胫病原菌和其他致病真菌活化培养，PDA液体培养基过夜培养后，取1.5mL菌液，收集菌丝体，双蒸水洗涤2 次；如图2所示，CTAB法提取基因组DNA ①加入500 μ 1的CTAB溶液，液氮中冷却 30s，立即放入65°C水浴中30s，重复3次；②加入玻璃珠漩涡振荡5min，65°C保温20min，期间摇动一次；③加入酚、氯仿、异戊醇，三者体积比为25 24 l，12000r/min离心lOmin， 上清液中加入氯仿、异戊醇，二者体积比为M l，12000r/min离心IOmin;④取上清，加入 2/3倍体积的_20°C预冷异丙醇沉淀，静置约30min ；⑤低转速离心，沉淀用70%乙醇漂洗2 次，再用无水乙醇漂洗1次，吹干，重悬于IOOul双蒸水中，-20°C保存备用。(2)黑胫病菌土壤总DNA的提取如图3所示，制备分生孢子悬浮液并接种土壤， 每份土壤3个重复；土壤样品中加入DNA提取缓冲液，37°C温浴30min，每5min混勻；然后加入20% SDS (终浓度为2% )，65°C水浴2h，每IOmin颠倒混勻，6000g室温离心lOmin， 以下处理步骤参照上述(1)方法中的步骤③ ⑤。该方法所得DNA的O拟60/0拟80为 1. 58 1. 81，提取到的DNA纯度较高，可以用以PCR扩增。土壤总DNA提取缓冲液的组成为IOOmmol/L Tris-HCl (ρΗ8. 0), 100mmol/L EDTA-Na2, 2% PVP, 1. 5mol/L NaCl, 1%CTAB, 125μ g/mL 蛋白酶 K。(3)引物的设计及特异性PCR扩增验证根据NCBI数据库中烟草黑胫病菌的18S rDNA基因序列，利用ft~imer5. O设计荧光定量PCR特异引物SP 5 ‘ -TGAAGAACGCTGCGAACTGC-3 ‘，AP :5，CTGACATCTCCTCCACCGACTA-3 ‘，扩增目的片段长度为17^p，引物由上海生工合成；将提取的烟草黑胫病病原菌基因组DNA和其他致病真菌的基因组DNA进行引物特异性检测，常规PCR扩增体系(25 μ 1)为=IOmM的dNTP2 μ 1，20mM的MgC122 μ 1，ρΗ8· 6 缓冲液2. 5 μ 1，双蒸水16μ 1，10μΜ的上下游引物各0. 5μ l，2u/deTaq酶1μ 1，DNA模板 0. 5μ 1。PCR反应条件是95°C预变性30s，95°C变性5s，60°C退火30s，35次循环。PCR产物以1. 2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，只有烟草黑胫病病原菌基因组检测到约170bp的条带， 表明引物设计特异性好。(4)检测灵敏度分析和标准曲线的制作以接种不同浓度病菌分生孢子的土壤 DNA为模板，检验该引物对土壤中分生孢子的灵敏度；以烟草黑胫病病菌基因组DNA的10 倍梯度稀释液为模板，检验引物SP/AP对基因组DNA的灵敏度，其检测下限为2fg/y 1基因组DNA，说明该引物具有很高的灵敏度。同时，选取不同稀释梯度的DNA为模板，荧光定量PCR扩增，制作标准曲线。荧光定量PCR扩增体系为1XSTOR Green (R) I Master Mix(TaKaRa)IOy 1，引物各为400nM，模板2 μ L，扩增体系为25 μ L0反应程序为94°C预变性 5min ；94°C变性 20s，65°C退火 40s，72°C延伸 40s, 72°C 10min，40 个循环。
(5)荧光定量PCR技术的应用提取不同烟草黑胫病发病程度土壤的DNA，用荧光定量PCR标准曲线进行定量分析，发现土壤中烟草黑胫病菌的数量与相应地块烟草的发病
程度一致。本发明提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，对土壤中烟草黑胫病菌进行 DNA提取以及分子检测，省去了传统的分离培养的方法，在时间上大大缩短了检测周期，整个检测0.5天即可完成；与普通PCR检测方法相比，无需后续的处理过程，并且能对结果进行实时监测；本发明设计的引物是基于病原菌ITS的易变区域设计的，经与近似菌种扩增验证，特异性好。本发明检测灵敏度高，可以检测出2fg/y 1的DNA，土壤中只有一个病原孢子的存在，即可检出。总之，本发明具有操作比较简单、灵敏度高等优点。本发明积极效果和优势在于在于(1)增加了土壤中总DNA的提取方法，土壤总 DNA提取缓冲液加入了 2%的PVP，能够去除土壤中部分杂质(如腐植酸等类物质)的污染，减少了对PCR效果的影响，大大提高了荧光定量PCR的检测灵敏度；( 设计引物特异性好，相近物种扩增时没有相应条带，所得产物的大小为172bp，适于荧光定量PCR反应条件；C3)荧光定量PCR的体系及反应条件根据所设计引物大小摸索条件所得，与所设计的引物相适应。焚光定量 PCR 扩增体系为1 X SYBR Green I Master Mix(TaKaRa)IOyUI 物各为400nM，模板2 μ L，扩增体系为25 μ L ；反应程序为94°C预变性5min ；94°C变性20s， 65°C退火40s，72°C延伸40s，72°C 5min，40个循环。综合上述条件，本发明提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，检测灵敏度更高，可以达到2fg/yl，高于现有技术提供的 0.6IOfg/μ 1的检测线。本发明实施例提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，本发明提供的用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，对土壤中烟草黑胫病菌进行DNA提取以及分子检测，省去了传统的分离培养的方法，在时间上大大缩短了检测周期，整个检测0.5天即可完成， 与普通PCR检测方法相比，无需后续的处理过程，并且能对结果进行实时监测，设计的引物是基于病原菌ITS的易变区域设计的，相近物种扩增时没有相应条带，所得产物的大小为172bp，经与近似菌种扩增验证，特异性好，适于荧光定量PCR反应条件，增加了土壤中总 DNA的提取方法，在土壤总DNA提取缓冲液加入了 2%的PVP，有效地去除了土壤中部分杂质的污染，减少了对PCR效果的影响，大大提高了荧光定量PCR的检测灵敏度，同时荧光定量PCR的体系及反应条件根据所设计引物大小摸索条件所得，操作简单，检测灵敏度高，可以达到2fg/ μ 1，土壤中只有一个病原孢子的存在，即可检出。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。


本发明属于植物病虫害检疫领域，提供了一种用于检测土壤中烟草黑胫病菌的方法，对土壤中烟草黑胫病菌进行DNA提取以及分子检测，省去了传统分离培养的方法，在时间上大大缩短了检测周期，与普通PCR检测方法相比，无需后续的处理过程，并能对结果进行实时监测，设计引物是基于病原菌ITS的易变区域设计的，相近物种扩增时没有相应条带，特异性好，适于荧光定量PCR反应条件，土壤总DNA提取缓冲液加入了2％的PVP，有效地去除了土壤中部分杂质的污染，减少了对PCR效果的影响，提高了荧光定量PCR的检测灵敏度，同时荧光定量PCR的体系及反应条件根据所设计引物大小摸索条件所得，检测灵敏度高，可以达到2fg/μl。