专利名称：一种林可霉素的清洁生产方法林可霉素，工业上又称洁霉素，是1962年由Mason从链霉菌培养物种分离得到的一种林可酰胺类抗生素，组分包括氨基酸和糖。林可霉素对革兰氏阳性菌有很好的抑制作用，它没有交叉耐药性而且本身的毒性较低，所以被广泛应用于有革兰氏阳性菌引起的疾病，同时对革兰氏阴性菌亦有一定的抑制作用。林可霉素在体内分布广，可进入骨髓和骨组织，临床广泛用于呼吸系统、骨髓炎及软组织感染等病症的治疗，尤其适用于对青霉素和红霉素过敏的病人。另外林可霉素亦是作为克林霉素、克林霉素磷酸酯、克林霉素棕榈酸酯等的起始原料。正是由于林可霉素的广泛应用以及巨大的市场需求，目前生产厂家众多，生产量巨大，据统计南阳普康、河南天方、安徽皖北、华北制药四家的年生产总量就在5000吨以上，然而由于目前全球环境问题日益突出，工厂的废水问题也越来越受到人们的关注，林可霉素的生产的废水的主要来源为有机溶剂萃取分层后的下层生产废水，废水中富含高浓度的磷(>40mg/L)、氮(氨基氮含量〉60mg/100ml)以及大量无机盐离子。尽管之前申请的大量有关林可霉素的专利中有涉及到林可霉素的生产废水处理，如中国专利CN1865175A (盐酸林可霉素生产废水处理剂及其制备方法和使用方法)、CN102079607A (一种林可霉素废水深度处理与中水会用工艺)都是集中在如何进行废水处理方面，治标不治本。若能在生产过程中有效循环利用生产废水，将会在提高原料利用率的同时可减少生产废水的处理成本和排放量，达到林可霉素清洁生产的目的
针对林可霉素发酵产生的废水对环境的污染问题，本发明提供了一种林可霉素清洁生产的新方法。本发明的技术方案:一种林可霉素的生产方法，包括种子培养、发酵培养工艺，混合醇提取工艺，其特征在于，经林可霉素产生菌发酵所得的发酵液，经过草酸酸化后进行板框过滤，过滤清液碱化后采用混合醇萃取，萃取液分层后下层水相经成分分析后补充适量的碳源、氮源、无机盐离子和水，组成循环发酵培养基，并使循环发酵培养基成分与初始培养基成分含量和指标相当或者相等，循环发酵培养基经调pH、灭菌后进行循环发酵生产林可霉素，从而构建成一个林可霉素循环发酵的清洁生产方法。所述发酵液经草酸酸化的pH范围为I 6，优选为3 3.5。发酵液酸化后的过滤清液碱化所使用的碱化剂为碳酸钠、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或多种，碱化pH范围为8 12，优选为10 11。所述的混合醇为二种或二种以上的正辛醇、正癸醇等C7 C11的一元醇，优选正辛醇和正癸醇，混合比例为正辛醇:正癸醇(v/v)=5:l 1:5。所述发酵初始培养基包括如下成分(按重量百分比计):淀粉糖化液5 20%，黄豆饼粉0.1 10%，玉米浆0.1 5%，硫酸铵0.1 3%，碳酸钙0.3 3%，氯化钠0.1 1%，磷酸二氢钾0.01 0.15%，余量为水，pH6.5 8.0。所述萃取液分层后下层废水相的还原糖、氨基氮、总磷和氯化钠指标进行分析后，补充适量的糖化液、黄豆饼粉、玉米浆、硫酸铵、碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾及工艺用水，调PH6.5 8.0，组成循环发酵培养基，使循环发酵培养基成分与初始培养基成分含量和指标相当或者相等。其中补充的糖化液量为初始发酵培养基中糖化液的70 95%，硫酸铵为初始发酵培养基中硫酸铵的10 40%，磷酸二氢钾为初始发酵培养基中磷酸二氢钾的20 50%，氯化钠为初始发酵培养基中氯化钠的20 50%。所用的发酵菌株为林肯链霉菌林可霉素产生菌lincolnensis、CPCC-200038菌株，可从中国药用微生物菌种保藏管理中心购买。循环发酵培养基的灭菌工艺条件为110 130°C、20 40分钟间歇分批灭菌。本发明采用循环发酵培养基进行好氧发酵时，发酵条件为:接种量为5% 15%(v/V)，发酵温度25 35°C，通风量为0.8 2.0v vm,罐压0.01 0.06MPa,搅拌转速为100 500rpm，发酵时间为170 208h。本发明的有益效果:本发明的林可霉素产品为药用级，在林可霉素的后提取过程中利用产品在不同PH条件下及不同溶剂中的溶解度不同的原理，采用有机溶剂萃取，萃取分层后产生大量的生产废水，该生产废水中富含丰富的氮、磷、无机盐等成分，若直接排放导致严重的环境问题，而生产废水的处理将大大增加林可霉素的生产成本。本发明通过对生产废水的成分组成进行分析，将生产废水纳入发酵培养基的配方中，构建林可霉素生产废水的循环利用工艺，循环次数为3 8次，生产废水的排放量减少为原工艺的10 30%，发酵过程培养基配制的用水量减少为原工艺的40 60%，减少原料糖化液、硫酸铵、磷酸二氢钾、氯化钠的用量，可降低生产成本。图1:林可霉素的生产工艺流程图 实施例1:林可霉素种子液制备 林可霉素产生菌为林肯链霉菌林可霉素产生菌kStreptomyces Iincolnensis)CPCC-200038 菌株斜面培养基:淀粉2%，氯化钠0.05%，硝酸钾0.5%，磷酸氢二钾0.1%，硫酸镁0.05%,硫酸亚铁0.01%。，琼脂1.8%，余量为水，pH自然。 种子培养基:淀粉1.5%，葡萄糖3%，豆饼粉1.5%，玉米浆2.5%，硝酸钠0.2%，硫酸铵0.2%，磷酸二氢钾0.05%,碳酸钙0.5%，豆油0.05%,泡敌0.01%,余量为水，pH值:
7.6 7.8 (消前)。母斜面种子制备:于无菌室内，无菌操作条件下取1/5铲砂土孢子接种于经培养一天无菌正常的试管斜面上，涂匀，于29°C相对湿度45%条件下培养6 7天，选择无菌正常、孢子丰满、外观良好的斜面于1-4°C冰箱保存备用，可保存一个月时间。子斜面种子制备:于无菌室内，无菌操作条件下取上述斜面孢子，用接种环刮取一环孢子，均匀涂布在试管斜面上，与母斜面相同的培养条件下培养5 6天，该斜面可于
1-4°C冰箱中保存备用，保存期10-15天。菌悬液的制备:于无菌室内，无菌操作条件下取培养好的试管斜面种子每管加5ml无菌生理盐水，刮下孢子，轻轻振荡即得菌悬液，将多管菌悬液转移至接种瓶中，作为接种种子罐备用。种子液培养条件:
接种量:每IL种子液用5个试管制备的菌悬液，温度:29 31 °C，过程pH在6.4 6.8之间，培养时间46 50h,罐压0.04mpa.种子液移种指标:
菌丝外观呈浅灰色，菌体镜检呈束团状，体粗，伸展有力，染色深，pH>6.7，还原糖(％)〈1.0，菌浓(v/v):30 40%ο
实施例2:林可霉素发酵液的制备
初始发酵培养基:淀粉糖化液6.5%，黄豆饼粉2%，玉米浆1.5%，硫酸铵0.38%，碳酸钙0.8%，氯化钠0.68%，磷酸二氢钾0.03%,余量为水，ρΗ6.5 8.0。补料培养基1:豆饼粉10%，玉米浆18%，碳酸钙0.8%，豆油0.05Kg/m3,泡敌0.01Kg/m3，余量为水，pH自然。补料培养基2:豆饼粉4%，玉米浆6%，硝酸钠2%，硫酸铵1%，磷酸二氢钾
0.05%，碳酸钙0.5%，豆油0.05Kg/m3，泡敌0.05 Kg/m3，余量为水，pH自然。发酵条件:
发酵过程在50L的发酵罐中实施，初始装液量50%，接种量为6%，搅拌转速300rpm，通风量1.2vvm,罐压0.04mpa,发酵温度30 ± I °C，发酵时间为180 208h，发酵前40h每隔4h取样，40h后每隔8h取样，样品测定指标包括还原糖、氨基氮、总磷、菌浓(％)、效价及复测pH。发酵过程中补料及pH等控制措施如下:
还原糖:接种后当还原糖降至1.2%以下后开始补糖，采用36%的糖化液控制发酵前IOOh还原糖量在1.2%，发酵IOOh后还原糖在0.8%，放罐前IOh停止补糖。pH:发酵前IOOh通过通氨控制在7.2 7.4，IOOh后pH控制在6.8 7.2，其中氨水浓度>20%。氨基氮:全程控制在30 40mg/100ml,采用氨水(发酵液pH偏低时)或者10%硫酸铵(发酵液PH偏高时)调节氨基氮水平。
补料:分别于发酵罐接种后32h、60h、110h、140h —次性补入2.5L、1.5L、1L、1L补料培养基1，于发酵罐接种后90h —次性补入2.5 L补料培养基2。
实施例3:林可霉素的广品制备
将实施例2中所得的发酵液约40L，采用草酸将发酵pH调至3.0，酸化液采用板框过滤，得过滤清液22L，过滤清液采用20%氢氧化钠溶液调pH至10.5，碱性滤液进行复滤确保碱液澄清，加入2/5体积的混合醇，开动搅拌20-30min，静止分层。上层有机相经真空浓缩、结晶、脱色、丙酮结晶、干燥等单元操作后得林可霉素产品。
实施例4:生产废水的循环利用和循环发酵培养基的配制 取实施例3中混合醇萃取液下层生产废水进行成分分析，结果如下表:
表1:生产废水中主要成分含量


本发明提供了一种林可霉素清洁生产的新方法。本方法采用林可霉素产生菌进行通风发酵，所得发酵液经过酸化后过滤，过滤清液经碱化后采用混合醇萃取，萃取液离心分离，上层有机相用于提取林可霉素，下层水相为生产废水，此生产废水经成分分析后作为下一批次发酵培养基的成分之一，进行重复多次利用。本发明充分利用生产废水中的有效成分，变废为宝，从而减少资源的浪费和环境污染，在降低生产成本的同时大大缓解了生产废水的排放所造成的环保压力。