专利名称：ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株及其构建方法Short Hairpin RNA (shRNA，翻译为“短发夹RNA”)，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环(loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制，连上5-6个胸腺嘧啶T作为RNA聚合酶III的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA” (siRNA)的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”(shRNA)，并被RNAi通道处理，之后结合到RNA诱导沉默复合物 (RNA-induced silencing complex, RISC)，这种复合物能够结合并切割与siRNA序列相匹配的mRNA上，导致mRNA无法翻译成相应蛋白质，最终沉默细胞中相应蛋白的表达。shRNA 整合入真核生物载体，利用U6或Hl启动子确保其在宿主细胞内高效表达。这种载体能够整合入宿主细胞基因组中，并随着细胞增殖能够传递到子细胞中，因此，其基因沉默的能力得以延续。RNAi技术是近年来快速发展起来的一项基因沉默技术，即在生物体细胞内，外源性或内源性的双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引起同源mRNA特异性降解，从而抑制目的基因表达的技术。它的出现为分析基因功能和信号传导通路以及基因治疗方面都提供了一种新的研究手段。与传统的反义核酸、基因剔除等技术相比，具有特异性强、针对性强、级联放大等优点。
鉴于国内外缺乏ERa 36缺陷型的人肿瘤细胞株及其相关研究的报道，本申请应用shRNA系统沉默人肝癌SMMC-7721细胞内源性ERa 36的表达，构建了 ERa 36缺陷型 SMMC-7721稳定转染细胞株SMMC-7721/Sh36，并对其功能进行了研究。这一细胞模型可用于研究ERa 36与肝癌的相关性及其机理；也可以用于研究雌激素在肝癌细胞中的信号传导通路；还可以作为研究雌激素的膜受体信号通路的细胞模型。本发明所述的的SMMC-7721细胞株购于中科院上海细胞所，它是人类原发性肝癌细胞，贴壁生长。本发明所述的ER a 36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株SMMC_7721/ai36的获得过程包括，将SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列片段，插入携带GFP绿色荧光表达基因的pRNAT-U6. Ι/Neo表达载体，再将重组质粒转入SMMC-7721细胞株，在SMMC-7721细胞中表达shRNA，经阳性细胞克隆筛选到SMMC-7721/ai36细胞株，使得siRNA靶向沉默了内源性ERa 36的表达量30%以上，且95%以上的细胞表达绿色荧光蛋白的稳定转染细胞。本发明所述的ERa 36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法由以下步骤组成一、shRNA序列、DNA模板的设计与合成的思路针对ER- α 36mRNA 5，-CGAAGGGAAGTATGGCTATGGAATCC-3，为目标设计 shRNA，再分别合成两条互补并含siRNA的正义链和反义链的DNA模板，中间以10个脱氧核苷酸的Loop 结构相连，后接RNA PloyIII转录终止位点，并在两端引入BamH I和HindIII酶切位点。综上，设计了对应ER-α36 基因的 shRNA DNA模板为SEQ ID NO :1 和 SEQ ID NO 2，送大连宝生物公司合成引物序列。本发明的一方面在于ERa 36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法，其包括如下步骤(a)设计对应ER- α 36基因的shRNA的两条单链DNA模板，其碱基序列为SEQ ID NO :1 禾口 SEQ ID NO 2 ；(b)构建含有上述碱基序列 SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 的 pRNAT_U6. 1/Neo 重组质粒；(c)利用如步骤(b)获得的重组质粒转染宿主细胞SMMC-7721得到的重组细胞株；(d)将步骤(c)所得重组细胞株经过G418筛选培养基培养，每3 5天更换一次筛选培养基，筛选10 14天，获得阳性克隆细胞株；其中，所述的G418筛选培养基为15% 新牛血清的RPMI-1640培养基中，加入G418使其终浓度为500ug/mL ；(e)将步骤(d)筛选所得的阳性克隆细胞株利用Western Blotting方法，和/或细胞计数法，和/或软琼脂糖集落形成实验法检测。上述构建方法中，其步骤(b)所述的构建方法包括如下步骤(f)取SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2两条单链DNA模板等浓度混勻后，经95°C加热lOmin，室温静置lh，稀释至终浓度lOng/ul ；(g)用T4DNA连接酶将步骤(f)所得产物与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体 pRNAT-U6. Ι/Neo 在 22°C连接 2h ；(h)将步骤(g)获得的连接产物转化感受态E. coli DH5a后，经细胞培养、提取质粒、测序鉴定结果如SEQ ID NO :3。本发明的另一方面在于上述构建方法所获得的ER a 36缺陷型SMMC-7721稳定转染的细胞株。有益效果本申请构建的ERa 36缺陷型SMMC-7721细胞与现有的技术的区别为ERa 36缺陷的人肝癌细胞，由于ERa 36本身是新近才发现克隆的，而且，肝脏不是雌激素靶器官，然而研究发现，肝癌却是雌激素依赖性肿瘤，因此，本申请构建的ERa 36 缺陷型SMMC-7721细胞株是全新的。并且，其构建的方法也不同于现有技术。本申请所用到的shRNA具有以下特点1.克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环 (loop)序列分隔的，组成发夹结构，由pol III启动子控制；2.两个互补的寡核苷酸两端带有HindIII及BamH I限制性酶切位点；3.已有研究发现，四个寡核苷酸较之原先推荐的23个寡核苷酸可以更有效地抑制目的基因；4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个C，使插入片段和启动子有一定空间间隔以确保转录的发生；5. ShRNA目的序列的第一个碱基是G，确保RNA聚合酶转录；6. shRNA插入片段中的茎环靠近寡核苷酸的中央；7.通过添加6个T在shRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。8.在正义链和反义链序列上没有出现连续3个或以上的T，否则可能导致shRNA 转录的提前终止；9. SV40启动子启动新霉素抗性基因表达可用G418筛选，可用以建立稳定转染细胞系；10.用CMV启动子启动绿色荧光蛋白GFP的表达，因此可直接通过荧光显微镜快速准确的追踪转染效率。图 1 为 shRNA-pRNAT_U6. 1/Neo 表达载体构建图；图2为质粒酶切鉴定图；其中，图中M为DNA分子量标准品，control为空质粒组， 将条带位置的胶切下后回收DNA片段，送去宝生物测序，测序结果与预先设计的序列相吻
I=I ο图3为SMMC-7721与SMMC_7721/Sh36细胞在光镜下形态图(IOX)；图4为转染48h的荧光照片(40X)；其中，图中在荧光显微镜下显示荧光的细胞， 证明了细胞转染成功。图5为转入ERa36 shRNA后，Western blot检测ER a 36及其同源亚型ER a 66蛋白的表达；其中，图中7721为未转染的SMMC-7721细胞，7721/V为转染空质粒的SMMC-7721 细胞，7721/ ι36为转染ER a 36低表达质粒的SMMC-7721细胞，β-Actin为细胞骨架蛋白， 在细胞内表达量相对一致，用作内参蛋白。如图所示，7721/证36组ER a 36蛋白表达量显著低于其它两组，证明所构建的ERa 36低表达细胞系符合预先设计。图6为GEL-pro Analyzer 4. 0对胶片中ERα 36蛋白条带灰度值的扫描定量值； 其中，图中，每组的扫描数值与所对应的β-Actin扫描数值相比，然后每组相互比较得出百分数值，用柱状图对其量化描述，如图所示，证明了 7721/Sh36组ER α 36蛋白表达量显著降低。图7为GEL-pro Analyzer对胶片中ERa 66蛋白条带灰度值的扫描定量值；其中， 图中，每组的扫描数值与所对应的β-Actin扫描数值相比，然后每组相互比较得出百分数值，用柱状图对其量化描述，如图所示，证明了 7721/a136组ERα66蛋白表达量无显著变化。图8为SMMC-7721与SMMC_7721/ai36细胞增殖曲线；其中，图中7721细胞在第二天便进入对数增长期，且细胞增殖速度较快，第四天进入平台期，滞留时间较短，第五天便进入凋亡期；而7721/Sh36细胞第三天进入对数生长期，第五天左右进入平台期，且滞留时间较长，第7天后才进入凋亡期。证明了 ERa 36表达降低后细胞接触抑制作用减弱，对恶劣环境的适应能力增强。图9为SMMC-7721与SMMC_7721/ai36细胞单细胞克隆形成实验；其中，图中7721/V为转染空质粒SMMC-7721，7721/Sh36为转染ERa 36低表达质粒的SMMC-7721细胞，证明了 ERa 36表达降低后，细胞克隆形成能力增强了，细胞可以摆脱贴壁后才能增殖的束缚。SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2是ER- a 36基因的shRNA DNA模板，送大连宝生物公司合成。

SMMC-7721 人类原发性肝癌SMMC-7721细胞系，以下缩写成SMMC-7721，在附图中缩写成7721表示。SMMC-7721/Sh36 是转染质粒 ER α 36 pRNAT_U6. 1/Neo 的 SMMC-7721 细胞，其构建过程如实施例1所述，在附图中缩写成7721/证36表示。SMMC-7721/V 是转染空质粒即pRNAT_U6. 1/Neo的SMMC-7721细胞，其构建过程如实施例1所述，在附图中缩写成7721/V表示。实施例1细胞株SMMC_7721/ai36的获得ERa 36-shRNA质粒由美国Creighton大学医学研究中心王兆一博士馈赠，它是通过克隆DNA寡核苷酸序列SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的基因，并将其重组于pRNAT_U6. 1/ Neo载体，从而构建成的特异性的ERa 36-shRNA。 (1) shRNA序列、DNA模板的合成对应ER- a 36 基因的 shRNA DNA 模板为SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2,人工合成此序列。(2)构建 ER- a 36 shRNA 表达载体ER-a 36 shRNA表达载体的构建示意图，如图1。取SEQ ID NO :1禾口 SEQ ID NO: 2两条单链DNA模板各lug/ul，混勻，95°C加热lOmin，室温静置lh，稀释至终浓度lOng/ul 待用，用T4DNA连接酶与BamH I和HindIII酶切后的线性化载体pRNAT_U6. 1/Neo在22°C 连接2h;获得连接产物。其中，IXT4 DNA连接酶缓冲液50mM Tris-HCl (pH 7.5，25°C)， IOmM MgCl2, IOmM 二硫苏糖醇(DTT)，ImM ATP。连接反应体系含有线性化载体pRNAT-U6.1/Neo DNA模板 T4 DNA连接酶 IXT4DNA连接酶缓冲液
0.5ul
补充终体积为10uL。
O.lug Iul(3)转化取步骤⑵的5ul连接产物，转化IOOuL感受态E. coli DH5 α，缓慢混勻，冰浴 30min，42°C水浴90秒，冰浴2min，加入900ul的SOC培养基，37°C下150转/min摇床培养 Ih ；收集菌液，分IOOul和900ul涂布加入100ug/ml Amp的LB固体培养基，37°C过夜培养。(4)鉴定挑斑点最大的两个单菌落，接种到50ml LB液体培养基(含100 μ g/ml Amp)中， 37°C振荡培养约12h，至对数生长后期。收集过夜培养的菌种，按照质粒提取试剂盒说明书(上海莱枫生物科技有限公司，商品货号DK302-01)提取质粒DNA ；将提取的质粒溶于20 μ 1 TE缓冲液(ρΗ8. 0) 中，-20°C储存。用紫外分光光度计检测其浓度，浓度为2 μ g/μ 1。将提取的质粒DNA，取1 μ g进行酶切鉴定酶切鉴定反应体系如下，反应温度37°C，反应时间1 ；获得酶切产物。限制性内切酶HindIIIΙμ
限制性内切酶BamH IΙμ
酶解缓冲液(IOxHbuffer)2μ1
提取的质粒DNAIpg
ddH2015μ1取酶切产物10 μ 1，用凝胶电泳鉴定酶切后产物，结果如图2，得到分子量 6500bp左右，将片段切下，经TIANgel Midi普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA片段， 送去大连宝生物公司测序，测序结果如SEQ ID NO :3与质粒设计图谱相吻合，证明最终获得质粒 ERa 36 pRNAT-U6. 1/Neo。(5)转染参照Lipofectamine 2000转染试剂盒的说明，转染前Mh，于6孔板中，每孔接种 SMMC-7721细胞6X IO5个，培养基为15%新生牛血清的RPMI-1640培养基，最终使接种浓度达到90%。转染前将6孔板中的培养基换成无血清无抗生素的RPMI-1640培养基备用。将4 μ g步骤(4)所获的ER a 36 pRNAT_U6. 1/Neo质粒DNA溶于250 μ 1无血清的
Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，混合均勻。将 10 μ 1 Lipofectmine 2000 溶于
250μ 1无血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium中，室温充分混勻5min。将溶解充分的 ERa 36pRNAT-U6. 1/Neo 质粒 DNA 和 Lipofectmine 2000 混合，室温孵育 20min，获得混合转染液。向上述6孔板中，每孔加入500 μ 1的混合转染液，前后振荡混勻。将6孔板放于 37 °C的CO2培养箱培养。(6)G418筛选阳性克隆上述6孔板培养4 后，将培养基吸除，加入G418终浓度为500ug/ml的RPMI-1640 培养基Iml进行阳性筛选，每3 5天更换一次筛选培养基，筛选1周。同时设置SMMC-7721 为对照组，进行观察。结果如图3，ERa 36低表达细胞系SMMC_7721/a!36具有贴壁能力增强，贴壁后细胞突出的分支较多，分散较为整齐，显微镜下观察细胞较透亮等特点。在终浓度500ug/ml的G418筛选浓度下，筛选10 14天后，可见有抗性的克隆出现，荧光显微镜观察GFP表达，如图4。将上述有抗性的克隆，为防止抗性丢失，继续在G418浓度减为400ug/ml的筛选培养基中进行维持筛选，培养3 4周，用肉眼即可看见明显克隆，最终获得ER a 36稳定低表达的混合克隆ERa 36稳定敲低的肝癌细胞株SMMC-7721细胞，命名为SMMC_7721/ai36。SMMC-7721/V 细胞的构建参照Lipofectamine 2000转染试剂盒的说明，转染前Mh，于6孔板中，每孔接种 SMMC-7721细胞6X IO5个，培养基为15%新生牛血清的RPMI-1640培养基，最终使接种浓度达到90%。转染前将6孔板中的培养基换成无血清无抗生素的RPMI-1640培养基备用。 将 4ug pRNAT-U6. 1/Neo 空质粒载体溶于 250 μ 1 无血清的Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，混合均勻。将 10 μ 1 Lipofectmine 2000 溶于 250 μ 1 无血清的Opti-MEM I Reduced SerumMedium中，室温充分混勻5min。将溶解充分的pRNAT_U6. 1/Neo空质粒载体和LipOfectmineTM2000混合，室温孵育20min，获得混合转染液。向上述6孔板中，每孔加入500 μ 1的混合转染液，前后振荡混勻。将6孔板放于 37°C的CO2培养箱培养。筛选步骤同上。实施例2 shRNA干扰效率检测及ER α 36活性测定(7) Western Blotting 检测 ER α 36 蛋白的表达单克隆鉴定细胞大量扩增后，利用Western Blot方法检测转染后细胞中ERa 36 蛋白的表达水平。分别抽提SMMC-7721/Sh36 和 SMMC-7721 以及 SMMC-7721/V 细胞的总蛋白，BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白。50ug总蛋白经10% SDS-PAGE胶在60V恒流电压下分离1. 5h ；将 SDS-PAGE中的蛋白转移至PVDF膜上，60V恒流电压转移45min，5%脱脂奶粉中封闭lh，分别与抗兔的ER α 36多克隆抗体和抗鼠的β-actin单克隆抗体在4°C环境下过夜孵育，再与 Horseradish Peroxidase(HRP)标记的二抗作用 2h 之后，通过 ECL (美国 GE Healthcare 公司，商品货号为RPN2109)化学发光和X光胶片曝光，其结果见图5。如图5所示，蛋白条带从左至右分别是SMMC-7721细胞样品，SMMC-7721/V细胞样品，SMMC_7721/ai36细胞样品中ERa36、ERa66以及内参β-actin蛋白的表达量。具体实施方法为SDS_APGE后，转膜一次，分别杂交三种蛋白的第一抗体与第二抗体(步骤方法如上所述)。ERa 36是ERa 66的一种亚型，二者同属于核受体超家族中的一员。本申请所构建的细胞系SMMC-7721/ai36专一性敲低ERa 36蛋白的表达量，而对ER a 66蛋白表达量无显著性影响，使用Gel-Pro Analyzer 4. 0软件对蛋白条带灰度值扫描定量，定量结果见图6、 7，结果表明 SMMC-7721 以及 SMMC-7721/V 的 ER α 36 表达量分别为 49. 7 士 8. 4 和 40. 2 士 5. 6 ； SMMC-7721/Sh36 细胞则为 21. 9士5. 3，是 SMMC-7721 细胞的 44% 以及 SMMC-7721/V 细胞的
，所以shRNA的干扰效率为56% (P < 0. 01)。(8) SMMC-7721/Sh36稳定转染细胞株的功能检测细胞计数法测定SMMC-7721和SMMC-7721/ai36细胞的生长曲线。分别接种对数生长期的SMMC-7721和SMMC-7721/Sh36细胞2X IO4个/孔于24孔板中，平行3个孔，每天同一时间平行操作，用0. 5%胰酶消化，血球计数仪中置于倒置显微镜下计数，共计8天。 结果显示两组细胞的对数生长期均为接种后的第三天。但SMMC-7721/a!36细胞倍增时间延长，然而，平台期维持的时间较长，说明细胞间接触抑制作用减弱，大量细胞能彼此接触并能持续生长较长时间。SMMC-7721细胞在第五天(对数生长期后第二天)便进入凋亡期， 然而SMMC-7721/a!36细胞在培养至第七天时才进入凋亡期，如图8。(9)软琼脂糖集落形成实验测定单细胞的增殖能力检测将1. 2%低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1 1的体积比混合制备0. 6%的底层琼脂，6孔板中每个孔1. 4ml温室凝固，取对数生长期的SMMC-7721和SMMC_7721/ai36细胞，胰酶消化后吹散成单个细胞悬液，计数，并分别调细胞浓度为10000个/ml，将0. 6 %低熔点琼脂糖与2X细胞培养基以1 1的体积比混合，制备0. 3%的上层琼脂，每孔加Iml 上层琼脂和IOOul单细胞悬液(约1000细胞/孔)，混勻，室温凝固。置于37°C ,5% CO2的细胞培养箱中培养2 3周，计数含50个细胞以上的克隆，计算细胞集落形成率，如图9。 结果SMMC-7721/Sh36细胞集落形成数量为20 士 13，显著高于SMMC-7721细胞0. 7 士 1. 2(P < 0. 01)。
综上所述本发明所构建的SMMC_7721/ai36细胞株，95%以上的细胞表达绿色荧光蛋白， 经shRNA靶向沉默了内源性ER α 36的表达量56%，即ER α 36的量仅为SMMC-7721细胞的 44%。与SMMC-7721/V细胞相比，细胞倍增时间延长，然而细胞间接触抑制作用减弱；克隆形成率升高，凋亡细胞数减少，提示沉默ERa 36的表达可增强原发性肝细胞癌的增殖侵袭能力。本申请所构建的SMMC_7721/ai36细胞系可广泛应用于研究ERa 36对肝癌细胞生物学行为的影响及其机制也可用于观察内源性ERa 36敲低后，细胞生长状况及其功能的改变，探讨ERa 36在肝癌细胞生长、增殖、分化及转移中的作用及其机理。


本发明公开了一种ERα36缺陷型SMMC-7721稳定转染细胞株的构建方法，具体是将SEQID NO1和SEQ ID NO2的核苷酸序列片段，插入含GFP绿色荧光的pRNAT-U6.1/Neo表达载体，再转入SMMC-7721细胞株，在SMMC-7721细胞中表达shRNA，经阳性细胞克隆筛选后，得到SMMC-7721/Sh36细胞株，使得siRNA靶向沉默了内源性ERα36的表达量30％以上，且95％以上的细胞表达绿色荧光蛋白的稳定转染细胞。这一细胞模型可用于研究ERα36与肝癌的相关性及其机理；也可用于研究雌激素在肝癌细胞中的信号传导通路；及作为研究雌激素的膜受体信号通路的细胞模型。