专利名称：用于特异地检测金黄色葡萄球菌的培养基和使用这种培养基进行鉴定和/或计数的方法描述本发明涉及用于特异地检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或用于区别凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基，这使得可能分离葡萄球菌属的细菌和鉴定金黄色葡萄球菌种，该培养基使用至少一种酶底物。本发明还涉及用于鉴定和可选择地计数金黄色葡萄球菌的方法，该方法使用这样的培养基。在1999年，葡萄球菌属包括43个种和亚种，在人类中发现有其中的17种。这些种的大部分在人中是机会致病菌，其在发生由于创伤或医疗产品的直接植入的皮肤损伤时显示出高风险。此外，金黄色葡萄球菌种是经常在一些患者中发现的细菌，这些患者必须接受包括装置如注射器或导管在内的医院治疗。因此检测这种日益与医院疾病有关的病原菌的存在具有极大的价值。在葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌毫无疑问地是最有毒力的种，因为其产生大量的细胞外酶和毒素。它可能是许多病理病症的原因，这些病症从简单的瘭疽至最严重的感染如败血症、心内膜炎、肺病或骨关节感染，这些病症的预后不是非常乐观的。另外，只有5个种(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和人葡萄球菌(Staphylococcushominis))代表了至少1％的在临床中心分离得到的病原菌株，它们独自地代表了超过98％的最通常遇到的葡萄球菌菌株。其他种很少遇到而且相对无病原性。在细菌学中，常规的是将这些以产生凝固酶为特征的金黄色葡萄球菌种与其他“凝固酶阴性”种进行对比。常规的用于区分金黄色葡萄球菌与非金黄色葡萄球菌的葡萄球菌的方法是基于搜索游离的凝固酶和DNA酶，和基于获得旨在证明存在血纤蛋白原亲和因子、A蛋白和荚膜抗原的乳胶上的凝集作用。应当注意到其他具有潜在病原性的葡萄球菌菌种能够表达凝固酶。凝固酶阳性种如下金黄色葡萄球菌、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、海豚葡萄球菌(Staphylococcus delphinis)、水獭葡萄球菌(Staphylococcus lutrae)和施氏葡萄球菌(Staphylococcus schleiferi)。存在有用于在选择性培养基上进行培养以评测金黄色葡萄球菌的存在的技术。它们为下列培养基·Chapman高盐培养基(含有75％的NaCl)通常对于金黄色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌具有选择性。这些细菌使得培养基由红色变成黄色。特别地，一些微生物和D组肠球菌(Enterococcus)能够在该培养基上产生同样的反应；因此检定过氧化氢酶是必需的(对于链球菌(Streptococcus)是阴性的)。·Baird Parker培养基(含有亚碲酸钾和氯化锂作为选择剂)用于分离和计数食品中凝固酶阳性葡萄球菌，其使得可能证明凝固酶的活性。在该培养基上，金黄色葡萄球菌和其他凝固酶阳性种的菌落显示出黑色的中心，周围环绕不透明的环。其他微生物能够在该培养基上生长。这主要包括下列类群革兰氏阳性球菌肠球菌属和李斯特氏菌(Listeria)属的，革兰氏阴性杆菌变形菌(Proteus)属和假单胞菌(Pseudomonas)属的。
事实上，使用Chapman高盐培养基技术的金黄色葡萄球菌的检测缺乏灵敏度(当菌种以低数量存在于待测试生物样品中时证实所寻找的该菌种的能力)和尤其缺乏特异性(在含有其他菌种的待测试生物样品中检测所寻找的菌种的能力)。
类似地，使用Baird-Parker培养基技术的金黄色葡萄球菌的检测缺乏灵敏度和特异性。因此，某些不属于金黄色葡萄球菌种的菌株(尤其是施氏葡萄球菌和腐生葡萄球菌)也能够给出周围环绕发亮晕圈的菌落。也有可能的是，一些金黄色葡萄球菌的菌株不表达所寻找的酶活性或者不在培养基上生长，因为它们可能以太少的数量存在于生物样品中和/或它们可能被培养基中具有太大选择性的成分抑制。
因此，可以理解用Baird-Parker和Chapman培养基的检测只能给出推测的诊断并需要其他测试来确认。目前，对于鉴定金黄色葡萄球菌所需的附加的处理增加了分析的持续时间和成本。其需要众多的试剂和具有相关资格的人员的参与。
也可能使用基于葡糖苷酶的底物，其使得可能依赖所使用的分子的构型来检测α-葡糖苷酶活性或者β-葡糖苷酶活性。
使用α-葡糖苷来鉴定各种葡萄球菌菌种是已经知道的。可是，研究由各种葡萄球菌菌种引起的这些糖的酸化通常不会允许金黄色葡萄球菌的简单鉴定，因为其不够特异(例如在麦芽糖、松二糖、蔗糖、海藻糖的情况下)或者不够灵敏(例如在甲基-α-葡糖苷、棉子糖、松二糖的情况下)(Bascomb S.和Manafi M.1998，酶测试在需氧和兼性厌氧革兰氏阳性球菌的表征和鉴定中的用途(Use of enzyme tests incharacterization and identification of aerobic and facultativelyanaerobic Gram positive cocci)，Clin.Microbiolo1.Rev.11318-340)(Kloos WE.等人1982，使用API Staph-IDENT的葡萄球菌菌种的鉴定(Identification of Staphylococcus Species with the API Staph-IDENT)，System.J.Clin.Microbiol.16(3)509-516)。这种事态不会倾向于鼓励研究科学家们在这种类型的α-葡糖苷酶活性上继续工作。
另一方面，近来的出版物提到用β-葡糖苷酶活性进行工作的优点。这例如为专利EP-B-0.741.797的案例，其描述了在选择性培养基上区分葡萄球菌属的细菌和其他细菌的方法，该方法使用两个基于吲哚氧基的生色底物，这使得可能检测葡萄球菌的磷酸酶活性和其他细菌属的β-葡糖苷酶活性。
与凝胶培养基上葡萄球菌的检测相比较，根据那个专利只可能区分葡萄球菌和其他属的细菌，而我们的发明能够区别金黄色葡萄球菌和其他葡萄球菌属的细菌。
在Gaillot O.等人的文章“用于从人临床样品中分离和推测鉴定金黄色葡萄球菌的新型生色培养基CHROMagar Staph.aureus的评测”(Evaluation of CHROMagar Staph.aureus，a new chromogenicmedium，for isolation and presumptive identification ofStaphylococcus aureus from human clinical specimens)(2000，J.Clin.Microbio1.38，4，1587-1591)中，描述和评测了一种用于分离葡萄球菌和鉴定金黄色葡萄球菌的的生色培养基CHROMagar(商标)Staph.aureus，其使用使得金黄色葡萄球菌显示紫色的生色底物。理论上，随后检测同一属的其他种时，它们显示蓝色或无色。这种用途基本上是由β-葡糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、β-半乳糖苷酶和磷酸酶活性形成的，还有抑制剂去铁胺(Deferoxamine)，其使得可能区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。此外，在此专题上已经申请了一个专利申请WO-A-00/53799。那个专利申请提出一个用于检测金黄色葡萄球菌的培养基，其结合了至少下列两种在上述专利申请EP-B-0.741.797中已经描述过的生色剂·5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯，磷酸酶活性，和·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基葡糖苷，β-葡糖苷酶活性。
实际上，该新的文献简单地和本质上向色素原中添加了称为去铁胺的生长抑制剂。该去铁胺使得可能更清楚地区别金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。目前，去铁胺作为表皮葡萄球菌的生长抑制剂已经是熟知的，但不是对于其他葡萄球菌菌种(Lindsay J.A.，Aravena-romanM.A.，Riley T.V.，通过测试对于去铁胺的敏感性来鉴定来自血液培养物的表皮葡萄球菌和人葡萄球菌(Identification of Staphylococcusepidermidis and Staphylococcus hominis from blood cultures by testingsusceptibility to desferrioxamine)，European J.of Clin.Microbiol.etInf.Diseases，1993，12卷，127-131页)。
与CHROMagar(商标)Staph.aureus培养基相比较，我们的培养基使得可能更容易地区分金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，这两个种在CHROMagar(商标)培养基上产生具有同样颜色的菌落。这是由于磷酸酶底物缺乏特异性造成的，其对于金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌是阳性的，还由于去铁胺对于表皮葡萄球菌的抑制只是部分的这一事实。
应当注意到，根据我们的发明只是通过检测α-葡糖苷酶活性就已经能够分开金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌和腐生葡萄球菌，它们是三种临床分离得到的主要葡萄球菌菌种。
实际上和出乎意料的是，发明者们已证明基于α-葡糖苷的底物能够形成金黄色葡萄球菌的灵敏而特异的鉴定。特别地，通过选择操作条件和/或特殊的α-葡糖苷酶底物和/或结合至少第二种能够限定反应培养基的酶底物，可能的是·区别最常分离到的主要凝固酶阳性葡萄球菌菌种(基本上是金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌)和最常存在的凝固酶阴性葡萄球菌(基本上是表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和腐生葡萄球菌)，和/或·特异地鉴定金黄色葡萄球菌。
例如，在特异性和在本发明的实践方面中的增进可通过添加至少第二种酶底物来获得。因此，该增进可通过下列程序来获得首先，检测α-葡糖苷酶活性，金黄色葡萄球菌强烈地表达出该活性，而其他葡萄球菌菌种则很弱地表达；其次，检测由大多数葡萄球菌表达的但不由金黄色葡萄球菌表达的β-葡糖醛酸糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶和/或β-葡糖苷酶活性，这是所使用的底物的功能。这第二个活性使得可能更清楚地区分金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属的其他种。
为了达到这种效果，本发明涉及用于检测金黄色葡萄球菌和/或凝固酶阳性葡萄球菌的培养基，其含有金黄色葡萄球菌培养基和至少一种用于证明α-葡糖苷酶活性的酶底物。
用于证明α-葡糖苷酶活性的酶底物为生色剂或荧光剂。
根据实施的第一个变化，用于证明α-葡糖苷酶活性的生色剂或荧光剂是基于吲哚氧基或基于伞形酮的，以便能够进行金黄色葡萄球菌和凝固酶阳性葡萄球菌的检测。
根据实施的第一个变化，该培养基使用下列生色剂·6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，和/或·4-甲基伞形酮-α-D-葡糖苷。
根据实施的第二个变化，用于证明α-葡糖苷酶活性的生色剂为基于萘酚的，以便能够进行金黄色葡萄球菌的检测。
根据实施的第二个变化，该培养基使用下列生色剂2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷。
根据一个实施方案，培养基使用至少两种不同的酶底物，优选的为两种生色剂，一种用于证明α-葡糖苷酶活性，另一种用于检测糖苷酶(osidase)(β-葡糖苷酶和/或β-葡糖醛酸糖苷酶和/或β-半乳糖苷酶)和/或酯酶(酯酶/脂酶和/或磷酸酶和/或硫酸酯酶)和/或肽酶和/或凝固酶活性。
另外，培养基使用选自下列对的两种生色剂·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷联合5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷，或·5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷联合6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷联合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸，或·6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷联合5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷。
优选地，培养基使用至少一种促进葡萄球菌属的细菌生长的抑制剂，如氯化锂(LiCl)、叠氮化钠(NaN3)、粘菌素、两性霉素、氨曲南、结肠霉素(colimicin)、氯化钠(NaCl)或去铁胺。
根据实施的一个变化，培养基使用抑制剂的混和物，其包括促进葡萄球菌属的细菌生长的四种抑制剂，这些抑制剂为·LiCl，·O/129，·氨曲南，和·两性霉素。
根据另一个变化，培养基优选地以100-300mg/L的浓度使用麦芽糖。
本发明也涉及用于在含有至少一个种的细菌的样品中鉴定一种或多种金黄色葡萄球菌种的细菌的方法，其包括下列步骤·用所有或部分样品接种如上所述的培养基，和·培育接种的培养基以便产生足够大小的细菌菌落，从而来观察该培养基中所使用的并已经反应的每个生色剂的显色或每个荧光剂的荧光。
该方法也可能计数样品中一种或多种金黄色葡萄球菌种的细菌；在这种情况下，进行第三个步骤，其为计数由与金黄色葡萄球菌种的细菌相关的显色或荧光鉴定出的菌落。
实验1由多种基于吲哚氧基衍生物的生色标记所组成的多种α-葡糖苷酶底物的评测在含有下列物质的基底(base)中制备下面的培养基·每升11克(g/L)的蛋白胨，·0.65g/L的TRIS缓冲液，和·14g/L的琼脂，同时结合有描述于下面表1中的生色α-葡糖苷酶底物
表1使用的生色α-葡糖苷酶底物的缩写将α-葡糖苷酶底物以200g/L的浓度溶解在二甲亚砜中。向四个融化的培养基中加入足够的体积以获得100mg/L的最终底物浓度。将来源于bioMérieux国际保藏的微生物以0.5 MacFarland的悬浮液接种于每一个培养基上，它们各自接种三个板。可是，用来源于对于公众可用的保藏(例如ATCC或NCTC)的微生物所获得的结果能够给出相同的结果。将培养皿于37℃培育48小时。在24和48小时的培育时间之后用肉眼检查菌落。注意显色以及该显色的强度。
在下面的表2中以及在随后的表中，C表示培育之后菌落的显色，I表示显色的强度，符号“-”与缺乏颜色或强度意义相同，和最后TI表示培育时间。应当注意到，显色的强度是人为标度，但是其对于测试的所有生物样品和所有培养基是共同的。这种标度对于该实验以及对于所有随后的实验是有效的。其可以下面的方法来定义·0相应于缺乏活性，·0.1相应于存在微量的显色，·0.5相应于存在非常浅淡的显色，·1相应于存在弱强度的清晰显色，·1.5相应于存在介于显色1和2中间的显色，·2相应于存在中等强度的真显色，·2.5相应于存在介于显色2和3中间的显色，·3相应于存在强显色，·3.5相应于存在介于显色3和4中间的显色，·4相应于存在非常强的显色。
结果给出在下面的表2中
表2由多种基于吲哚氧基衍生物的生色标记所组成的多种α-葡糖苷酶底物的评测对于底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，在24小时于葡萄球菌菌株之间获得了显色强度的差异，这使得可能鉴定金黄色葡萄球菌和能够区别金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属的其他种。在48小时，不确定性就可能存在于金黄色葡萄球菌和木糖葡萄球菌之间。
对于其他三种底物，培育时间在下面的意义上没有影响，即在24小时与在48小时一样，显色强度的差异使得可能鉴定金黄色葡萄球菌和能够将其与葡萄球菌属的其他种区别开来。
可是，要注意的是，使用三种底物6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷、6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷和5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷时金黄色葡萄球菌菌株和木糖葡萄球菌菌株(凝固酶阴性)之间的强度差异更加显著，其给出了标记颜色和培养基颜色之间更好的对比，并比5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷更特异。
实验2通过在凝胶培养基中直接检测α-葡糖苷酶活性和另一种糖苷酶活性来区分金黄色葡萄球菌和同一属的种在含有下列物质的基底中制备下面的培养基·每升11克(g/L)的蛋白胨，·0.65g/L的TRIS缓冲液，和·14g/L的琼脂，同时结合有两种生色底物，其中一种使得可能检测α-葡糖苷酶活性。这些复合底物给出在下面的表3中
表3生色α-葡糖苷酶底物和对于其他酶活性特异的生色底物的多种组合的缩写每个α-葡糖苷酶的原溶液以200g/L在二甲亚砜中制备。向四个融化的培养基中加入足够的体积以获得每个α-葡糖苷酶底物100mg/L的最终浓度。同时将足够体积的上述用于每一个其他糖苷酶活性的底物加入四个培养基中，其浓度依赖于底物为50-200mg/L。将来源于bioMérieux国际保藏的微生物以0.5 MacFarland的悬浮液接种于每一个培养基上，它们各自接种三个板。将培养皿于37℃培育48小时。在24和48小时的培育之后用肉眼检查形成的菌落。注意显色以及该显色的强度。
结果给出在下面的表4中
表2多种底物组合的评测上面的结果显示出，在测试的所有生色底物对的情况下，培育24小时之后能够区别金黄色葡萄球菌和其他最通常遇到的种(表皮葡萄球菌，腐生葡萄球菌等等)。
使用颜色的范围和/或使用颜色强度研究底物对A、B、C和D，它们中的每一个使得可能区别多种葡萄球菌菌种。首先，显色的差异使得可能明确地检测出木糖葡萄球菌；其次，对于金黄色葡萄球菌而获得的最高水平的颜色强度使得可能将其与具有同样显色的同一属的其他种区分开来。
只有中间葡萄球菌种会在使用底物对A时的48小时引起问题；可是，在培育的24小时无不确定性，这更为有利，因为鉴定周期越短培养基越有效。中间葡萄球菌是凝固酶阳性葡萄球菌菌种，不能通过大多数的鉴定方法(尤其是在Chapman、Baird Parker和CHROMagar(商标)Staph aureus培养基上)将其与金黄色葡萄球菌区别开来。
实验3一种我们的含有实验2中描述的底物混和物的培养基与商购可得的培养基的比较研究下面用于检测生物样品中金黄色葡萄球菌的存在的培养基可以从下列公司获得·来自CHROMagar公司(巴黎，法国)的CHROMagar Staphaureus培养基(索引号TA600)，和·来自bioMérieux公司(Marcy l’Etoile，法国)的Chapman培养基(索引号43311)和Baird Parker培养基(索引号43521)。
在下面的表5中给出的培养基的缩写如下·A相应于含有实验2中描述的混和物A的培养基，·B相应于CHROMagar Staph aureus培养基，其用于分离葡萄球菌和用于通过菌落的桃红色显色来鉴定金黄色葡萄球菌种，而其他葡萄球菌菌种给出青绿色或者为无色，·C相应于Chapman培养基，其用于分离金黄色葡萄球菌和水解甘露醇的葡萄球菌，这些细菌将培养基中存在的颜色指示剂从红色变为黄色，和·D相应于Baird Parker培养基，其用于分离和表征金黄色葡萄球菌，该细菌在24小时内产生具有黑色中心并周围环绕发亮环带(称为晕圈)的特征性菌落，这相当于凝固酶的检测。
将临床测试中最通常遇到的属于12种葡萄球菌菌种的36个菌株在上述培养基中进行测试。将来源于bioMérieux国际保藏的这些微生物以0.5 MacFarland的悬浮液接种于每一个培养基上，它们各自接种三个板。将培养皿于37℃培育48小时。在24和48小时的培育之后用肉眼检查形成的菌落。根据实施例1中描述的方法和标度标注我们的培养基上和CHROMagar Staph aureus生色培养基上的菌落的显色。对于读取Chapman培养基，符号“-”相应于有色指示剂没有变化，在菌落周围琼脂保持红色(甘露醇-菌株)；符号“+”相应于有色指示剂有变化，在菌落周围琼脂变成黄色(甘露醇+菌株)。对于读取Baird Parker培养基，符号“-”相应于在菌落周围没有发亮的晕圈(凝固酶-菌株)；符号“+”相应于在该菌落周围存在有发亮的晕圈(凝固酶+菌株)。
在下面的表5中，显色相应于培育之后菌落的显色；首字母“C.M.”表示培育之后在菌落周围Chapman培养基的显色；“晕圈”表示培育之后在菌落周围Baird Parker培养基的发亮环带；最后，符号“No”表示根据培养基通过特异性显色或晕圈来鉴定的每个种的菌株数量。
表5根据本发明的培养基与商购可得的培养基的比较金黄色葡萄球菌的所有菌株在根据本发明的培养基上和在CHROMagar Staph aureus与Chapman培养基上得到了鉴定。另外，中间葡萄球菌(凝固酶阳性种)的菌株在根据本发明的我们的培养基上以及在CHROMagar Staph aureus与Baird Parker培养基上得到了鉴定。结果也显示出在根据本发明的培养基上和在Baird Parker培养基上没有鉴定出假阳性。还要注意到，在CHROMagar Staph aureus培养基上和在Chapman高盐培养基(含有75％的NaCl)上不可能区别金黄色葡萄球菌和某些凝固酶阴性种。因此，进行旨在证明存在该金黄色葡萄球菌的附加测试是必需的。
该实验证明了根据本发明的方法的特异性和可靠性。
实验4用含有基于萘酚衍生物的α-葡糖苷酶底物的培养基进行各种操作条件的评测下面的实验在液体培养基中和在基于萘酚衍生物的生色底物存在的条件下进行。
将培养基和底物分装入由bioMérieux公司(Marcy l’Etoile，法国)生产的API“galleries”(商标)中。
这些“galleries”构成了用于在微生物中搜寻酶活性的半定量方法，并使得可能快速和同时研究19种酶活性。每个“galleries”包含有20个杯形器，其中分装有含有酶底物的溶液。这些酶测定通过将65μl 5-6McFarland的细菌悬浮液分装入每个杯形器中来进行。
每个杯形器的显色强度在37℃培育4小时之后和在添加下列合适的试剂之后用肉眼进行检查ZYM A(索引号70470)和ZYM B(索引号70480)，它们可以从上面提到的bioMérieux获得。显色强度直接与被酶水解的底物的数量成比例。
然后根据下面的分类在结果表单上给显色强度的值进行打分分数0相应于阴性反应；分数5相应于最大强度的反应；分数1、2、3和4表明显色的中间水平，并由此表明酶活性的中间水平。关于该打分的更详细的信息可以在由同名的“galleries”所提供的API读取标度中找到。
与实验1或2中一样，微生物来源于bioMérieux国际保藏。
寻找的酶活性和相应的萘酚衍生物底物描述于下面的表6中
表6用由萘酚衍生物组成的生色底物所寻找的酶活性的列表酶活性的结果给出在下面的表7中
表7α-葡糖苷酶活性检测为阳性的金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌菌种相比较的鉴定根据上面表7中的结果，只有用2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷底物检测由金黄色葡萄球菌菌株强烈表达的α-葡糖苷酶活性才使得可能区别该凝固酶阳性种和其他葡萄球菌菌种。对于其他酶活性，金黄色葡萄球菌菌株和其他种的菌株之间的显色强度差异具有低得多的显著性，这使得难以区别各种菌种。应当注意到，在基于萘酚的生色底物的情况下，区别凝固酶阳性葡萄球菌如中间葡萄球菌是不可能的。其他葡萄球菌即腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌是凝固酶阴性的。
实验5使用其他非生色底物如荧光底物的α-葡糖苷酶的检测下面的培养基在实验1中描述的培养基基底中配制，但是无琼脂并存在有荧光底物来替代生色底物。为了强调使用荧光底物来证明凝固酶阳性葡萄球菌菌种的优点，比较了表8中描述的四种荧光底物对于下列酶活性的特异性
表8测试的荧光底物的缩写将底物溶解在实验1和2中使用的溶剂中，每个底物的最终浓度为每升培养基200mg。
将各种液体培养基分装入支持物的杯形器中，支持物有银行信用卡大小并对于bioMérieux公司的自动化VITEK2(商标)系统是特异的。整合了培育器的VITEK2系统可操作从接种至结果报道的所有步骤。只是0.5McFarland的接种物的制备由操作者使用浊度计来进行，对于每一个菌株直接在对于系统特异的管中进行测试。该自动化系统使得可能在19个小时内以规则的15分钟间隔通过浊度测定法读取细菌的生长和通过荧光读取酶活性。
和实验1、2和4中一样，所研究的菌株为bioMérieux国际保藏的一部分。
下面的表9中给出的结果表示以小时计的对于获得可用仪器测量的荧光最大水平所需的培育时间
表9概括了对于获得每一个菌株的每种酶活性的荧光最大水平所需要的培养时间结果的分析显示出，通过用基于伞形酮的荧光底物检测α-葡糖苷酶活性可能来区别凝固酶阳性种(金黄色葡萄球菌和中间葡萄球菌)和凝固酶阴性种(表皮葡萄球菌、木糖葡萄球菌、腐生葡萄球菌和溶血葡萄球菌)，它是作为读取时间的函数的。特别地，α-葡糖苷酶水解4-MU-α-GLU使得可能对于凝固酶阳性葡萄球菌菌株在培育的8小时之前获得荧光最大水平，对于凝固酶阴性菌株在培育的10小时之后获得荧光最大水平。
对于所研究的三种其他底物，看来难以区别凝固酶阳性葡萄球菌菌株和凝固酶阴性葡萄球菌如表皮葡萄球菌，因为达到这些菌种的荧光最大水平的时间与凝固酶阳性种给出的时间非常接近，乃至实际上是相同的。
该实施例清楚地举例说明了用荧光底物检测α-葡糖苷酶活性的一个优点。
实验6根据本发明的酶底物与可增进α-葡糖苷酶的检测的抑制剂的混和物为了进一步增强我们的底物的特异性进行了许多研究。在设想的解决方法中，添加抑制剂导致了相当令人惊讶和特别有利的解决方法。
设想了某些抑制剂的组合，因为没有抑制剂可以独自地使葡萄球菌的检测能够得到增强。在这些之中，大多数阻止了本领域的技术人员继续沿着这些线路来寻找解决方法，属于这种情况的例如·第一个组合是三种抑制剂的组合，即氯化锂LiCl(2g/L)、两性霉素(0.005g/L)和氨曲南(0.008g/L)。葡萄球菌的生长非常轻微地受到这三种化合物的影响；另一方面，对于检测的酶活性(α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶)无影响。
·抑制剂混和物的第二个组成与前述的测试相同，只是LiCl(于3g/L-7g/L变化)和氨曲南(同时于0.008g/L-0.003g/L变化)的浓度同时进行了修改(交叉浓度范围的制备)。当LiCl的浓度增加时，葡萄球菌的生长减少。对于氨曲南没有观察到该影响，浓度的增加没有干扰细菌的生长。关于酶活性，抑制剂(无论怎样的浓度)没有影响α-葡糖苷酶和β-葡糖醛酸糖苷酶的检测。当抑制剂的浓度增加时，选择性得到了增强，但是葡萄球菌的繁殖力降低了。
·首先用粘菌素和其次通过增加氨曲南的浓度来完成前述的抑制剂混和物。与向培养基中添加粘菌素一起的该增加基本上不影响葡萄球菌的生长。此外，因为在前述测试中鉴定的临界种在这些新的条件下被抑制，所以增强了选择性。在氨曲南存在的情况下α-葡糖苷酶的检测灵敏度非常轻微地降低了，无论所使用的浓度为多少(0-32mg/L)。
·培养基性能水平、葡萄球菌与非葡萄球菌的繁殖力和酶活性的表达于存在前述测试中定义的抑制剂混和物(LiCl、氨曲南、两性霉素和粘菌素)的情况下进行了评测，但是是对于更广泛的菌株样品进行的评测。向培养基中添加这四种选择剂只引起了葡萄球菌生长的非常轻微的降低，和总体上没有影响金黄色葡萄球菌中α-葡糖苷酶的表达水平。另一方面，β-葡糖醛酸糖苷酶活性的检测/表达在存在这些抑制剂的情况下明显地改变了。选择性仍然不是完美的，尤其是关于李斯特氏菌、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)和芽孢杆菌(Bacillus)。
·接着，加入弧菌抑制剂化合物O/129，增加氨曲南的浓度(32mg/L)，从抑制剂混和物中除去粘菌素，和表征β-葡糖苷酶活性。下面的实验在下列培养基中进行-20.1g/L的蛋白胨，-0.65g/L的Tris缓冲液，-14g/L的琼脂，-0.125g/L的6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷，-0.100g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，-0.0018g/L的氯化锰，和-4g/L的丙酮酸钠。
此外，抑制剂的混和物具有下列组分-5g/L的LiCl，-0.010g/L的O/129，-0.032g/L的氨曲南，和-0.005g/L的两性霉素。
所有培养基的性能水平令人惊讶的好。特别地，葡萄球菌菌种的生长是适当的。此外，α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶活性的检测没有受到抑制剂的影响，和由于抑制了非葡萄球菌(李斯特氏菌、不动杆菌、克雷伯氏菌等等)的生长，所以选择性水平是令人满意的。
实验7通过添加麦芽糖来增强对于弱接种物的灵敏度下面的实验在含有下列物质的培养基中进行-20.1g/L的蛋白胨，-0.65g/L的Tris缓冲液，-14g/L的琼脂，-0.125g/L的6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷，-0.100g/L的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，-0.004g/L的氯化锰，-4g/L的丙酮酸钠，
-4g/L的氯化锂，-0.032g/L的氨曲南，-0.002g/L的两性霉素，和-最终浓度为0或0.1或0.3或0.4g/L的麦芽糖。
将麦芽糖以例如100g/L的浓度溶解在水中，然后向三个融化的培养基中加入足够的体积以获得上述的最终浓度。将来源于bioMérieux国际保藏的葡萄球菌菌株以稀释至1/30000的0.5MacFarland的悬浮液各自接种于每一个生色培养基上(在整个培养皿的表面进行密集的垂直划线)。将培养皿于37℃培育48小时。在18、24和48小时的培育之后用肉眼检查菌落，并给菌落的显色强度打分。
在测试的浓度中，用100和300mg/L的麦芽糖获得了最好的结果；这些为因此在下面的表10中给出的浓度。尽管用400mg/L的麦芽糖获得的结果相当好，但是由于一些其他的凝固酶阴性葡萄球菌也具有α-葡糖苷酶活性从而可能会有假阳性。
表10麦芽糖对于葡萄球菌α-葡糖苷酶活性的影响的评测标记显色并给这些显色的强度打分。读取的标度与上面用于表2和4的一样。
麦芽糖因此活化了金黄色葡萄球菌和尤其是临界菌株(3、4、5和6)的α-葡糖苷酶的表达，从而使得这些菌株能够在含有麦芽糖的培养基上产生绿色/亮绿色菌落，然而这些菌落在无麦芽糖的情况下会保持白色，这就会有如上面解释的给出非金黄色葡萄球菌鉴定的风险。
混杂的下列揭示α-葡糖苷酶的生色底物可以从下列公司获得·来自BIOSYNTH(Staad，瑞士)的5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，索引号为B-7230，·上面提到的来自BIOSYNTH的6-氯-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，具有索引号C-5015，和·6-溴-3-吲哚氧基-α-D-葡糖苷，其合成在Inalco公司的专利WO 99/50438中进行了描述，和·2-萘基-α-D-吡喃葡糖苷，其对于本领域的技术人员来说是熟知的，并可从例如Sigma公司获得。
揭示α-葡糖苷酶的荧光底物4-甲基伞形酮-α-D-葡糖苷对于本领域的技术人员来说是熟知的，并可从例如Sigma公司获得。
关于5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-D-葡糖苷，其可以下列途径进行合成具有下面分子式的5-溴-4-氯-1-甲基吲哚-3-基-α-D-葡糖苷 可从5-溴-4-氯-3-吲哚基乙酸酯或从5-溴-4-氯吲哚基1，3-二乙酸酯获得。
步骤15-溴-4-氯-N-甲基-3-吲哚基乙酸酯的合成将3mmol的上述的这个或那个酯溶解在35ml的无水二乙脂中，并通过添加过量的醚中的重氮甲烷-三氟化硼复合物在1位氮上进行甲基化。用1M盐酸提取有机相，然后用水洗涤并干燥(Na2SO4)。除去溶剂，然后将剩余物在五氧化二磷存在的情况下在真空中干燥从而获得0.62g的产物。
步骤25-溴-4-氯-1-甲基-3-吲哚基-α-D-葡糖苷的合成A.将上面获得的N甲基化的乙酸酯(0.6g，2mmol)溶解在无水的乙酸乙酯中，然后在氩气环境下通过添加过量的甲醇氨水进行水解。于环境温度16小时之后，通过在减压的条件下进行蒸发来除去溶剂和过量的氨，固体剩余物无需进一步的纯化而直接进行糖基化。
B.将5-溴-4-氯-1-甲基吲哚-3-基溶解在二氯甲烷中，并于0℃用五乙酸葡萄糖酯的二氯甲烷溶液(1.45g，5mmol/20ml)进行处理，然后用溶解在二氯甲烷中的氯化锡(2mmol)进行处理，同时进行搅拌。让该反应持续过夜，然后通过与1M冰冷的盐酸一起搅拌来分离产物。在除去锡盐之后，有机相通过PHASE-SEP纸进行过滤，并通过MgSO4进行干燥。在TLC中，于UV下检测到两个点。在硅胶柱上的第一次分离(以二氯甲烷-乙酸乙酯作为洗脱剂)之后，两种化合物在甲醇钠的甲醇溶液存在的情况下分别进行脱乙酰化，从而得到α-和β-葡糖苷的混和物。
C.α形式看来是主要的，剩余的β-葡糖苷可以通过下列方法除去，即将其溶解在热水中，然后冷却至37℃，并在β-葡糖苷酶存在的条件下进行温育。过滤溶液并用醚提取靛蓝色素。剩余的水溶液在减压的条件下进行蒸发，然后进行冻干，从而获得α-葡糖苷(120mg)。
揭示β-葡糖醛酸糖苷酶的生色底物6-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸可以从BIOSYNTH(Staad，瑞士)获得，索引号为C-5050。
也揭示β-葡糖醛酸糖苷酶的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷酸可以从BIOSYNTH获得，索引号为B-7400。
揭示β-半乳糖苷酶的生色底物6-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷可以从BIOSYNTH获得，索引号为C-5000。
揭示β-葡糖苷酶的生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-葡糖苷可以从BIOSYNTH获得，索引号为B-7250。


本发明涉及用于特异地检测金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和/或用于区别凝固酶阳性葡萄球菌与凝固酶阴性葡萄球菌的培养基，这使得可能分离葡萄球菌属的细菌和鉴定金黄色葡萄球菌种，该培养基使用至少一种酶底物，优选的为生色剂或荧光剂，更加优选的为基于吲哚氧基或基于萘酚的试剂。本发明还涉及用于鉴定和可选择地计数金黄色葡萄球菌的方法，该方法使用这样的培养基。该培养基由金黄色葡萄球菌培养基和至少一种用于证明α－葡糖苷酶活性的酶底物组成。本发明在诊断领域中找到了首选的应用。