专利名称：一种提高cp4-epsps在汉逊酵母中表达量的方法转基因植物蛋白质计量方法和计量标准的缺乏使得检测结果无法溯源，因此难以保证检测结果的准确性和可比性。现有的检验技术无法对转基因食品中各种影响安全性的因素进行全面准确的测定。为了适应转基因植物的发展和应用的要求，我国必须迅速发展转基因蛋白质安全性评价，研究转基因植物蛋白质计量方法和计量标准，建立转基因植物蛋白量值溯源传递体系。1981年，Schnepf等人首次成功地克隆了编码Bt杀虫晶体蛋白，揭开了利用基因工程培育抗虫植物的序幕。到目前为止，全球转基因作物的目标基因种类已达到数百种，主要包括抗虫、抗病、抗除草剂、抗逆和品质改良等。从现有产业化利用的转基因植物来看，抗虫和抗除草剂转基因植物占的比例最大，广泛应用的抗虫基因主要有两种，即来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因和来源于植物的蛋白酶抑制剂因子基因。抗除草剂基因主要有来自农杆菌CP4菌株的EPSPS基因等。烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPQ是莽草酸途径中的一个氨基酸合成必需酶，是许多除草剂如草甘膦作用的首选靶标酶。草甘膦是一种有机磷类除草剂，是目前推广面积最大和经济效益最高的除草剂，它可以特异地抑制EPSPS活性。科研人员将微生物来源的CP4-EPSPS基因导入多种农作物中，获得的转基因农作物具有良好的抗草甘膦效果。在各种转基因作物中，抗草甘膦转基因作物(含CP4-EPSPS)的种植和销售最为广泛。由美国Monsanto公司开发的抗草甘膦油菜和大豆在全球油菜和大豆种植面积中占很大的比例，近年来，我国每年进口的几千万吨大豆绝大部分都属于这种转基因作物。虽然现在市场上有大量的用于CP4-EPSPS转基因蛋白质测定的试剂盒，但不同的厂商可能采用不同的工艺表达、分离纯化原料，以及不同的方法确定参考物质的量值，而蛋白质检测标准物质和量值溯源传递体系的严重缺乏使得不同试剂盒内所带参考物质不能溯源到上一级的计量标准，也就无法保证不同试剂盒所带参考物质量值的准确性与可溯源性，造成测定结果不准确和缺乏可比性，对生物安全监管带来隐患，由此产生一系列法律、贸易等经济和社会问题。因此，在我国范围内，尽快研制CP4-EPSPS蛋白标准物质，建立起灵敏准确的定量测定方法及CP4-EPSPS转基因植物蛋白量值溯源传递体系，对于今后保证测定结果的溯源性、准确性和可比性，显得十分迫切且意义重大。近几年来，随着人们对汉逊酵母(Hansenula polymorpha)生物学特性的深入研究，发现其作为外源基因表达宿主的优势逐渐显现。汉逊酵母也是一种甲醇营养型酵母，与毕赤酵母类似。汉逊酵母中甲醇代谢的主要途径有两种(Lodeboer A.M.，et al. , 1985)一种是在过氧化物酶体中进行，甲醇在甲醇氧化酶(methanol oxidase, MOX)作用下生成甲醛和H2O2，甲醛再经甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase)和甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase, FMD)作用下生成C02，H2O2在过氧化氢酶(catalase，CAT)的作用下生成H2O和& ；甲醇的另一个代谢途径发生在过氧化物酶体外，甲醇在细胞质中经过一系列酶的催化作用最后转变为糖类，其中二羟丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase,DHAS)是这一过程的关键酶。甲醇代谢过程中的各种关键酶，包括Μ0Χ、DHAS和CAT等的表达都是在转录水平进行调解的，它们受甲醇、甘油和山梨醇的诱导，受葡萄糖和乙醇的阻遏，但当葡萄糖浓度低于0. 时，阻遏作用即被解除。在甲醇完全诱导条件下，过氧化物酶体可占细胞总体积的80%，M0X和DHAS可占细胞总蛋白的15%，它们的启动子具有极强的启动下游基因表达的功能，目前已被用作外源基因在酵母中表达的常用启动子。诱导型启动子以其强启动功能和严紧的调控机制被广泛的应用于外源基因的表达，已有很多外源蛋白在这些启动子的调控下在汉逊酵母细胞中得到高效的表达。目前用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的诱导型启动子都需要在一定剂量甲醇存在的条件下才能发挥作用，但由于甲醇是有毒物质，且易燃易爆，这样就限制了该系统在医药或食品等领域的应用。因此，各种组成型启动子就应运而生，已经成功应用于汉逊酵母外源蛋白表达系统的组成型启动子有质膜AIPase启动子(pPMAl)和翻译延伸因子Ia启动子(TEFl)等，这些组成型启动子的应用不仅无需在发酵培养基中加入甲醇，而且也简化了发酵工艺和降低了成本等。汉逊酵母作为外源蛋白表达宿主多采用营养缺陷型菌株来进行重组子的初步筛选，目前已得到多种营养缺陷型菌株，如亮氨酸缺陷型、甲硫氨酸缺陷型和酪氨酸缺陷型等(Seon AhCheon, et al.，2009)。同时，由于汉逊酵母对氨基糖苷类抗生素敏感，G418、Zeocin和潮霉素B等抗生素抗性基因也被广泛地用作筛选标记。以汉逊酵母作为外源基因的表达宿主时，外源DNA整合到酵母基因组中主要可分为随机整合和同源重组，其中同源重组需要导入的DNA中必须含有汉逊酵母的同源序列。同源序列与酵母基因组中某段DNA序列完全或部分一致，从而导致外源DNA在此位置可通过同源交换整合到酵母基因组中。汉逊酵母转化常用的同源序列包括各种强启动子和rDNA(Klabunde J. , et al. ,2003)序列，而本发明首次采用了汉逊酵母质膜AIPase基因作为同源整合序列。真菌质膜AIPase是上世纪70年代末首次在粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)中被发现的，随后分别从粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中得到提纯。质膜ATPase是酵母质膜中含量最多的蛋白，占总质膜蛋白的15%，占总细胞蛋白的0. 3%，它的主要作用是作为一个跨膜的质子泵，维持细胞内的PH值和电化学梯度，从而使多种营养物质得以运输。汉逊酵母质膜AIPase (Helen Cox, 2000)基因全长^97bp，编码898个氨基酸。本发明中首次将其插入到汉逊酵母表达载体中作为外源基因整合的同源序列。作为外源基因的表达宿主，汉逊酵母具有许多优点1)汉逊酵母的最适生长温度在37 43°C，菌体生长速度快，发酵时间短；2)以rDNA作为整合的同源序列，可以获得高拷贝的转化子，有可能极大地提高外源重组蛋白的表达量；幻多个外源基因能够通过一步法同时被整合到酵母基因组中，并按照一定剂量关系同时或分别表达。上述优点使汉逊酵母表达系统迅速发展成为最具魅力的真核表达系统之一，目前，已经有多种外源蛋白基因在汉逊酵母中获得了表达，见表1 表1在汉逊酵母中表达的部分外源蛋白本发明涉及基因工程领域，具体涉及使用一个复合增强子以实现CP4-EPSPS融合蛋白基因在多型汉逊酵母细胞中以组成型方式高效表达的方法，其中包括1)使用一个复合增强子以提高密码子优化后的CP4-EPSPS融合蛋白基因在汉逊酵母中的产量；2)采用毕赤酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子调控CP4-EPSPS融合蛋白基因在汉逊酵母中以组成型的方式表达；3)优化后的汉逊酵母发酵培养生长条件；4)利用纳滤及镍柱亲和层析快速提纯该重组外源蛋白的方法。而由此方法制备的CP4-EPSPS重组融合蛋白可作为蛋白质标准物质备选物应用于蛋白质溯源研究等领域。