专利名称：一种百日咳杆菌CpG-ODNs作为防治哮喘的药物的制作方法非甲基化的寡核苷酸单链(CpG-ODNs)是一种主要存在于细菌体内的DNA序列，可与免疫细胞(树突状细胞等)内体TOLL样受体(TLR) 9结合形成二聚体，经调节Thl/Th2 平衡抑制变应性哮喘。百日咳杆菌为一类致病性微生物，标准化百日咳疫苗的常规接种可显著降低百日咳疾病的发病率，全细胞百日咳疫苗选择性增强人和动物的Thl型反应，这与菌体内CpG-ODNs有关，其可显著减轻小鼠哮喘模型的气道炎症及细胞因子分泌等，维持 Thl/Th2的平衡，减轻哮喘症状。已知人工合成CpG-ODNs序列可抑制动物模型的变应性哮喘，但对人变应性哮喘几乎无效，这与TLR-9识别CpG-ODNs位点不同有关，基于全细胞百日咳杆菌无种属特异性，我们分析其CpG-ODNs序列不同于人工合成CpG-ODNs，对人及动物均有防治变应性哮喘活性。Vetor NTI Advance软件为生物科技公司Invitrogen的产品，是目前整合度最高的多功能桌面序列分析软件包，通过功能模块化可实现序列同源性比对、分析等功能。酶联免疫吸附法(ELISA )把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的一种检测技术。受检标本与载体表面的抗原或抗体起反应，再加入酶标记的抗原或抗体，最后加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)通过转录酶作用将目的RNA反转录为cDNA，再通过普通PCR扩增目的片段，最后电泳检测，分析电泳图条带从而获得目的基因相对表达量。蛋白质杂交技术(western blot)通过提取总蛋白，进行电泳后分离出不同分子量的蛋白，电转移至膜载体，抗原抗体反应后可通过分析蛋白条带反映出蛋白相对表达量。
本发明的目的是提种一种新型的防治哮喘的药物。本发明所说的防治哮喘的药物，是一种百日咳杆菌CpG-0DNS(Seq A)，它的序列如 SEQ ID NO 1 所示。上述所说的百日咳杆菌CpG-ODNs (seq A)在制备防治哮喘药物中的应用。本发明经实验表明腹腔注射百日咳杆菌CpG-ODNs (seq Α)可以抑制哮喘的炎症反应，预防或控制哮喘发作。这是以TLR-9信号分子产生信号转导、“Thl/Th2失衡”为理论基础，本发明发现了 seq A对哮喘相关细胞因子的调整和抑制气道炎症的作用。打破了以 “抗炎、舒张气道平滑肌”为靶点对哮喘的传统治法，建立了 “哮喘预防为主”的新途径，从而为控制发作及预防哮喘开辟新途径。图1是.ig百日咳杆菌CpG-ODNs对小鼠BALF中WBC及EOS影响；其中seq A可有效下调BALF中WBC及E0S，与其他序列比较作用最强。与其他各个序列组比较，差异有显著性。图2是ip百日咳杆菌CpG-ODNs对小鼠BALF中WBC及EOS影响；以seq AipT 调BALF中WBC及E0S，作用最强，与其他各序列组比较，差异有显著性。本实验根据Genebank提供的WPI国际标准株基因组序列。Genebank中选择 Genome选项，搜索并下载百日咳杆菌(Bordetella pertussis)基因组全序列，将全序列文件导入Vector NTI Advancell软件；查阅文献，获取三条具有抗变应性哮喘活性的 CpG-ODNs (0DN-1018、0DN-1026、0DN-3234)；应用 vector NTI Advance 软件比对(Blast) 已知效应序列0DN-1018、0DN-1026、0DN-3234与百日咳杆菌基因组，获得9条同源性最高序列，9条序列如下
表1.百日咳杆菌CpG-ODNs
NameSequencesSeqA5，-TCCAAGACGTTCATGGCGAT-3，(SEQIDN0 1)SeqB5，-TGCATGACGATCCTGCCGAT-3，(SEQIDN0 2)SeqC5，-ACCGCGACGTTATAGGCGTT-3，(SEQIDN0 3)SeqD5，-ATGACGGTAACGACCGGATG-3，(SEQIDN0 4)SeqE5’ -AAGAAGCTGACGTTGAGATG-3，(SEQIDN0 5)SeqF5，-CAGTTGTGAACGTCCGCAAGC-3，(SEQIDN0 6)SeqG5，-TGCCAGGCGTCTTCATG-3，(SEQIDN0 7)SeqH5，-ACGAAGGCGTCCTTGTT-3，(SEQIDN0 8)SeqI5，-GCTCAGACGTTTCTGGT-3，(SEQIDN0 9)
2.哮喘模型的建立
取Babl/c雌性小鼠，采用卵白蛋白(OVA)致敏法，分别于实验的第0和14天致敏小鼠。第16-18天每天雾化吸入1% 0VA，激发30min，建立急性哮喘模型；连续激发8周，建立慢性哮喘模型。对照组小鼠以生理盐水代替OVA。3.灌胃及腹腔注射
目前，常用的CpG-ODNs灌胃剂量为100 μ g/只，腹腔注射剂量为50 μ g/只。按照上述方法建立小鼠哮喘模型，使用两种给药途径给药。4.百日咳杆菌CpG-ODNs对气道炎症的影响
制备小鼠急性哮喘模型，于末次激发24h内，收集并检测BALF，计算BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞数。实验发现百日咳杆菌CpG-ODNs普遍具有减少气道炎症中白细胞总数及嗜酸性粒细胞数的作用，其中作用最强序列为seq A，且腹腔注射组作用优于灌胃组 (见表2，表3，图1及图2)。表2. ig 给药组 BALF 中 WBC 及 Eos 计数()


本发明提供了一种新型的防治哮喘的药物，是序列如SEQIDNO1所示的百日咳杆菌CpG-ODNs。所述的百日咳杆菌CpG-ODNs(seqA)可以抑制哮喘的炎症反应，预防或控制哮喘发作。这是以TLR-9信号分子产生信号转导、“Th1/Th2失衡”为理论基础，本发明发现了seqA对哮喘相关细胞因子的调整和抑制气道炎症的作用。打破了以“抗炎、舒张气道平滑肌”为靶点对哮喘的传统治法，建立了“哮喘预防为主”的新途径，从而为控制发作及预防哮喘开辟新途径。