专利名称：一种可同时沉默nkg2d的多种配体的rna干扰载体，及其构建方法和应用的制作方法RNA干扰(RNAi)，是指与靶基因同源的双链RNA诱导的特异的转录后基因沉默现象，这是生物体在长期进化过程中用于控制细胞内特定基因活化以及调节基因活化程度的一种机制。自1998年被发现以来，RNA干扰技术被研究人员用来特异性地剔除或关闭特定基因的表达，得到了广泛的应用并取得了迅速的发展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。小RNA的制备方法主要有5种化学合成siRNA，体外转录，RNaseIII消化长片段dsRNA，siRNA表达载体和siRNA表达框架。其中，前三种主要都是体外制备siRNAs，而后两种是从转染到细胞的DNA模板在体内转录得到siRNAs，后者由于不需要直接操作RNA，具有更高的转染效率和高稳定性。而这些，都主要集中在编码一个短小干扰RNA的技术层面上。然而，自然情况下，一个分子通常可以与多个不同配体分子相互作用。比如，表达于天然免疫细胞表面的天然免疫活化受体NKG2D有多种不同的配体分子，在机体受到压力诱导，包括病毒感染，DNA损伤等情况下，这些不同的配体分子在其相应细胞上都会有不同程度地上调表达，通过与NKG2D受体相互作用，引起天然免疫细胞(NK细胞、NKT细胞)的活化，介导早期免疫应答。HBV S抗原转基因小鼠对ConA诱导的急性损伤过度敏感，是由于HBV S抗原转基因小鼠的肝脏实质细胞上NKG2D的配体Rael和Multl显著升高，通过与NKG2D相互作用，引起肝脏NK细胞过度活化所造成的(Yongyan Chen, Zhigang Tian, et al. Increased susceptibility to liver injury in hepatitis B virus transgenic mice involves NKG2D_ligand interaction and natural killer cells. Hepatology, Vol.46, No. 3，2007)。在polyl: C联合D-GalN诱导的肝脏爆发性损伤中，polyl: C模拟双链RNA病毒感染，引起KupfTer细胞表面Rael分子表达上调，通过与NKG2D相互作用，促进了 NK细胞活化，引起了爆发性的肝脏损伤(Xin Hou, Zhigang Tian, et al. NKG2D-Rael recognition between natural killer cells and Kupffer cells in a novel murine natural killer cell-dependent fulminant hepatitis. Hepatology, Vol.49, No. 3, 2009)。在这些模型中，由于NKG2D配体分子的上调，促进NKG2D依赖的NK细胞活化，从而介导免疫应答和免疫损伤。目前，实验过程降低这种依赖于NKG2D的免疫损伤，主要是通过抗体阻断和RNA干扰这两种手段。然而，抗体阻断受限于抗体的蛋白质本质，作用时间短，因此需要多次给予， 并且代价昂贵。对于RNA干扰手段，由于NKG2D表达于游走性的淋巴细胞上，因此靶向NKG2D 分子的RNA干扰，随着淋巴细胞的迁移而失去作用，效果难以稳定。相比较下，RNAi抑制固有细胞上NKG2D的配体分子则更具可操作性。然而，NKG2D受体的配体分子是多样的，包括 Rael，Multl和H60，这些不同的配体分子都能够和NKG2D高亲和力结合，介导免疫应答。因此，多靶点RNA干扰技术亟待发展。我们构建一个单一载体，能够针对NKG2D不同配体分子同时编码多个小干扰RNA，通过对滞留性肝脏实质细胞上这些配体分子的基因沉默，来封闭 NKG2D与它们的相互作用，与抗体阻断相比起来，这种方法不仅封闭效果明显，而且大大延长了干扰时相，降低了抗体的昂贵费用。发明内容本发明涉及一种可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体及其构建方法及应用，该方法构建了一种可编码NKG2D的多个配体分子(Rael，Multl和H60) shRNA的单一载体，该载体可以进一步构建成具有感染能力的编码NKG2D多配体shRNA的腺病毒或腺病毒穿梭质粒。该载体可同时沉默不同的靶基因，对PolyI:C/D-GalN联合注射引起的依赖于 NKG2D的爆发性肝炎有着明显的治疗作用。本发明的技术方案在一个方面中，本发明提供一种NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统，其中在载体中含有至少一种配体分子的小干扰RNA结构单元以及任选地性对照shRNA寡核苷酸编码序列。在一个实施方案中，在载体中包含二种配体分子的小干扰RNA结构单元。在一个实施方案中，在载体中包含三种配体分子的小干扰RNA结构单元。在一个实施方案中，所述配体为Rael，Multl或H60。在一个实施方案中，针对Rael的小干扰RNA序列为SEQ ID NO 1-3的序列；针对Multl的小干扰RNA序列为SEQ ID NO :4_6的序列；针对H60的小干扰 RNA序列为SEQ ID NO :7_9的序列。在一个实施方案中，无义干扰RNA序列为SEQ ID NO: 10的序列。在一个实施方案中，所述的载体是腺病毒穿梭载体或者腺病毒载体。在一个实施方案中，所述腺病毒穿梭载体是pRNAT-Hl. 1/shuttle质粒。在一个实施方案中，所述腺病毒载体是pAdeno-X质粒。在一个实施方案中，所述小干扰RNA结构单元含有相应分子的发夹结构小干扰RNA的DNA序列、位于该DNA序列上游的HI. 1启动子和位于该DNA序列下游的TTTTTT终止子。在一个实施方案中，所述的载体所含的发夹结构小干扰RNA的DNA序列由位于中间的茎环序列和分别位于该茎环序列两侧的有义链和与该有义链互补的反义链构成。在第二个方面，本发明提供第一方面所述的NKG2D多配体RNA干扰单一载体用于制备预防和/或治疗肝炎的药物的应用。在一个实施方案中，所述肝炎为PolyI :C/D-GalN 联合注射引起的依赖于NKG2D的爆发性肝炎。在一个实施方案中，所述载体的施用方式为静脉注射。在第三方面中，本发明提供前述NKG2D多配体RNA干扰单一载体表达系统的构建方法，包括以下步骤A.在腺病毒穿梭质粒中，分别插入Rael，Multl，H60的小干扰RNA结构单元以及阴性对照shRNA寡核苷酸编码序列，构建NKG2D单配体RNA干扰载体；B.设计带酶切粘端的引物，从上述A步骤所构建的单配体RNA干扰载体上分别扩增其shRNA转录单位，包括上游启动子，编码发夹结构小干扰RNA的DNA序列、下游终止子； 其中shRNAl的下游引物所引入的酶切位点与shRNA2的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位点与shRNA3的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，如此顺序下去；C.通过PCR的方法，用以上引物分别扩增得到大量的各配体分子的shRNA转录单位，用相应的限制性内切酶对PCR产物进行切割并回收，进一步用DNA连接酶将酶切后的 shRNA转录单位的PCR产物首尾相连，得到NKG2D多配体shRNA转录单位大片段；D.用限制性内切酶双酶切消化C步骤所得到的NKG2D多配体shRNA转录单位大片段，与同样酶切线性化的腺病毒穿梭质粒连接，构建NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体。在一个实施方案中，上述方法进一步包括下述步骤E.用归巢核酸内切酶双酶切D步骤所得到的NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体，回收包括NKG2D多配体shRNA转录单位大片段在内的片段；F.用相同的归巢核酸内切酶双酶切复制缺陷型重组腺病毒载体，回收腺病毒骨架片段；G.进一步用DNA连接酶将A步骤和B步骤所得到的回收片段连接起来，得到NKG2D 多配体RNA干扰重组腺病毒载体；H.线性化NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体，并转染进适合的宿主细胞，在其中包装成具有复制能力的完整腺病毒颗粒。具体地，本发明构建方法的优选实施方案为1、以siRNA表达载体如pRNAT-Hl. 1/shuttle为骨架，构建常见的单个shRNA表达载体，包括 pRNAT-shRael，pRNAT-shMultl，pRNAT-shH60，pRNAT-shNeg。所涉及的 RNA 干扰序列分别是Rael 1 :GACCAAUG⑶UACCCACAU(SEQ ID NO 1)2 :AGCCAAGAUCAACCUCAAG(SEQ ID NO 2)3 :CAGCAAGUGCUCUUUGCUA(SEQ ID NO 3)Multl-1 G⑶UAACAG⑶CAGA⑶CU (SEQ ID NO 4)2 :GACUAACACAACCGGAAAG(SEQ ID NO 5)3 :AGCUGACUGCCAGUAACAA(SEQ ID NO 6)H60-1 :CUGAUAACAGCA(iUGCCAU(SEQ ID NO 7)2 :UGCUCA⑶GAAUGGAAAGA(SEQ ID NO 8)3:CCUGGAGAGAAA(iUCAUUC(SEQ ID NO 9)无义RNA干扰序列GAGACCCUAUCC⑶GAUUA(SEQID NO 10)2、设计不同引物通过PCR的方法从单个shRNA表达载体上扩增得到相应的 shRNA 转录单位，包括 HL 1 promoter+Rael shRNA, HI. 1 promoter+Multl shRNA, HI. 1 promoter+H60 shRNA,HI. 1 promoter+Neg shRNA。其中，shRNAl 的下游引物所引入的酶切位点与shRNA2的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，而shRNA2的下游引物所引入的酶切位点于shRNA3的上游引物所引入的酶切位点为同一种限制性内切酶，如此顺序下去。其中shRNAl的上游引物与最后一个小干扰RNA转录单位shRNAx的下游引物所引入的酶切位点为pRNAT-Hl. 1/shuttle质粒自有酶切位点，分别为Bgl II和Nde I，引物序列见表2。
3、通过DNA连接酶将具有相同粘性末端的shRNA转录单位进行连接，得到NKG2D 多配体shRNA转录单位大片段，并通过Bgl II和Nde I双酶切后进一步连接到同样酶切线性化的pRNAT-Hl. 1/shuttle质粒上，构建成NKG2D多配体RNA干扰单一载体pRNAT-shRae l-shMultl-shH60-shNeg。
4、通过PI-Sce I、I_ceu I双酶切上述步骤获得的NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体 pRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg，将切下的 shRael-shMultl-shH60_shNeg 片段整合到复制缺陷型腺病毒载体pAdeno-X上，构建成NKG2D多配体RNA干扰腺病毒载体 pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg。具体地，用 PHce I 和 I-Ceu I 双酶切 D 步骤所得到的NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体，回收包括NKG2D多配体shRNA转录单位大片段在内的片段，与同样酶切线性化的复制缺陷型重组腺病毒载体(pAdeno-X)连接，得到 NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg，并进一步通过脂质体lipofectamine 2000将I^ac I酶线性化的NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体转染进猴胚肾细胞系293细胞，在其中包装成具有复制能力的完整腺病毒颗粒。
本发明提供的NKG2D多配体RNA干扰单一载体的特点
1.同时表达NKG2D三个不同的配体分子的小干扰RNA，通过高压注射的方式，能够有效地下调肝脏局部环境，尤其是肝脏实质细胞上这三个配体分子的表达，从而对于NKG2D 分子与这三种配体分子的相互作用都有干预效果，大大地降低了 polyI:C联合D-GalN注射引起的依赖于NKG2D分子的肝脏炎症反应。实验证明，在polyl C联合半乳糖胺D-GalN诱导小鼠爆发性肝炎模型中，用本发明所构建的NKG2D多配体RNA干扰单一载体提前3天对小鼠进行预处理，可以有效地抑制小鼠肝脏损伤。与NKG2D双配体RNA干扰载体，以及NKG2D 单配体RNA干扰载体相比，多配体RNA干扰载体效果更为明显。这表明NKG2D的多个不同的配体都不同程度地参与了该受体所介导的免疫反应，因此，该载体对于肝脏炎症反应的保护效果更为突出。
2.能够以腺病毒成熟颗粒的方式，通过非高压注射的普通静脉注射方式，高效地感染肝细胞。实验证明，同时干扰小鼠NKG2D三种配体分子的重组腺病毒，在提前10天对小鼠进行预处理后，仍然可以高效低抑制polyI:C联合D-GalN注射引起的爆发性肝损伤。
本发明的目的
针对NK细胞活化性受体NKG2D有多个不同配体的情况，提供一种单一载体编码多个shRNA表达的构建方法，实现一个载体能够同时编码NKG2D多个配体的shRNA，以增强 RNA干扰技术对NKG2D分子与其多个不同配体相互结合与作用的阻断效果，并且能够实现将该载体进一步重组到腺病毒载体上，优化了 RNA干扰的应用手段并扩大了其应用范围， 克服了抗体阻断的时效短，代价昂贵的不足。
本发明的主要创新点
1.本发明实现一个单一载体对NKG2D多个不同配体分子同时进行RNA干扰；
2.本发明通过单一载体实现对固有细胞表面分子的RNA干扰，而非淋巴细胞表面分子，延长干扰时相；
3.本发明通过对NKG2D多个不同配体分子的同时干扰，明显降低polyI:C联合半乳糖胺D-GalN诱导小鼠爆发性肝炎，对临床基因治疗的RNA干扰有着指导意义，发展了 RNA 干扰临床治疗的手段；4.本发明所构建的NKG2D多配体分子RNA干扰重组腺病毒，与现有很多多靶点 RNA干扰载体比起来，具有更高效的感染能力，并具有临床应用的潜力。


图1至图3为单配体RNA干扰载体，包括pRNAT_Hl. 1-shRael, pRNAT-Hl. 1-shMultl, pRNAT-Hl. l_shH60，pRNAT-shNeg 质粒构建过程，其中图1表示Clontech在线siRNA设计工具所选择的基因RNA干扰序列(Rael和H60 均根据其不同亚型的共同mRNA片段来选择)；图2表示体外合成并退火得到含有编码BamH I和HindIII酶切位点的编码shRNA 的 DNAs ；图3表示pRNAT-Hl. I/Shuttle质粒用BamH I、HindIII双酶切消化，回收大片段， 并将图2得到的退火寡核苷酸双链插入pRNAT-Hl. 1/Shuttle质粒；图 4 至图 5 为多配体 RNA 干扰载体 pRNAT-shRael-shMultl-shH60_shNeg 构建过程，其中图4表示pRNAT-Hl. 1/Shuttle质粒用Bgl II、Nde I双酶切消化，回收大片段；图5表示通过不同上下游引物从单配体RNA干扰载体上扩增shRNA转录单位，其中p3+p2扩增第一个shRNA片段，pl+p2扩增中间的shRNA片段，pl+p4扩增最后一个shRNA 片段，通过相同酶切位点串联各shRNA片段(PRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg为例)；图6用Bgl II、Nde I双酶切消化图5得到的长shRNA片段，形成粘性末端，插入图4得到的大片段中，形成环型质粒pRNAT-shI ael-shMultl-shH60-shNeg，即NKG2D多配体 RNA干扰载体；图7用PI-Sce I、I-ceu I双酶切消化图6所得质粒 pRNAT-shRael-shMultl-shH60-shNeg以及复制缺陷型腺病毒载体pAdeno-X，分别回收小片段和大片段，连接二者形成环型质粒pAdeno-shRael-shMultl-shH60-shNeg，即NKG2D多配体RNA干扰重组腺病毒载体；图8表示本发明所涉及的NKG2D多配体、双配体、单配体RNA干扰载体以及无义干扰对照载体；图9表示本发明所构建的NKG2D多配体、双配体、单配体RNA干扰载体对其涉及的靶分子的基因沉默作用；图10表示NKG2D多配体RNA干扰腺病毒穿梭载体有效地抑制小鼠血清转氨酶水平；图11表示NKG2D多配体RNA干扰腺病毒有效地抑制小鼠血清转氨酶水平

实验材料


本发明公开一种构建可同时沉默NKG2D的多种配体的RNA干扰载体的方法及其应用，该方法构建了一种可编码NKG2D的多个配体分子(Rae1，Mult1和H60)shRNA的单一载体，该载体可以进一步构建成具有感染能力的编码NKG2D多配体shRNA的腺病毒载体。该载体可同时沉默不同的靶基因，从而达到治疗疾病的目的。作为该载体的应用，该载体能够下调肝脏局部微环境，包括肝脏实质细胞表面Rae1，Mult1和H60的表达水平，并且对于NKG2D依赖的爆发性肝炎有明显的预防治疗作用。本发明发展了多靶点RNA干扰技术，对多靶点的基因治疗具有重要的实际意义。