专利名称：广藿香新品种的培育方法中药广藿香为为唇形科植物广藿香iPogostemon cab I in (Blanco)Benth.)的干燥地上部分。广藿香植物原产于东南亚各国，现在中国广东和海南省都有栽培供药用。广藿香是制备“藿香正气丸”、“抗病毒口服液”等中成药的主要药用材料，具有芳香化浊、开胃止呕、发表解暑并兼有抑菌抗病毒、抗螺旋体等功效。广藿香的主要用途是提取精油供医药和香料/化妆品工业生产需要，目前市场供不应求。据统计，我国每年的广藿 香精油需求量约220吨，而产量只有50多吨，大部分依赖进口 ；此外，广藿香精油还对植物病原真菌和农业害虫有抑制和毒杀作用，可用于绿色农药的生产。有关药理学实验表明广藿香精油中的杀菌活性成份是广藿香酮，对多种细菌、皮肤真菌有抑制作用。世界各地种植的广藿香除了在形态、气味、药材产量上有差异外，其药材中的有效成分含量也有差别。研究者在对不同产地的广藿香的精油成分分析中发现，我国各地的广藿香可以按其精油的组分划分为“酮型”和“醇型”两个化学型，“酮型”广藿香主要产广州市郊石牌村和肇庆、高要地区，俗称“石牌广藿香”或“牌香”，其精油中含有较高的广藿香酮(药效成分)，但药材产量和精油的产量都很低；“醇型”广藿香主要产于广东湛江和海南万宁地区，俗称“海南广藿香”或“南香”，其药材和精油的特征与国外广藿香原种的相似，即产量高但药用成分的含量很低，药效差，只适合作为化妆品工业用。产于广东省广州石牌地区的广藿香品种被公认为品质最好的品种，但由于城市发展、耕地压缩，以及产量低、育种困难等原因，石牌广藿香已濒临灭绝，仅在少数研究单位内有保存。所以迫切需要培育优质高产的广藿香新品种。由于广藿香罕见开花，生产上主要靠扦插繁殖，因此无法通过传统杂交育种方法来改良广藿香的品质；并且由于目前对广藿香中有效成分的生物合成途径及其调控基因尚不完全清楚，因此，通过转基因方式进行广藿香药效成分的品质改良目前还很困难；而通过常规组织培养方法获得的再生植株不能根本改变“石牌”和“海南”两个广藿香栽培变种的品质特点，已有报道广藿香育苗技术研究主要在抗病品种的筛选培育方面。总之，目前广藿香药材中没有一个产量高、有效成分含量也高的品种，也没用相应的育种研究报道。
本发明的目的是提供一种广藿香新品种培育方法，培育出具有石牌广藿香的有效成分广藿香酮高含量的优良品质，又具有海南广藿香的高产量的优质广藿香新品种，为广藿香种植业提供优质高产的种源，也为中药生产企业提供了新的药源。为达到本发明目的是通过下述技术方案实现广藿香新品种的培育方法，是一种利用原生质体融合技术获得新品种的方法，它采用悬浮细胞酶解法、沉降法分离纯化得原生质体，将受体的原生质体用碘乙酰胺处理，供体的原生质体用紫外线照射后用聚乙二醇诱导进行不对称融合，得到的融合产物置于看护培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基进行培养诱导出体胚直至获得完整的再生苗，将再生苗再转移到促进植株发育的培养基中培养获得新品种的，具体步骤如下 (1)悬浮细胞的培养分别采用两个不同品种的广藿香无菌苗顶芽下第2 3对展开叶片，采用常规法接种到愈伤组织培养基中诱导出愈伤组织，愈伤组织每隔15 25天继代一次；愈伤组织经两次以上继代培养后，取疒10克接种于100毫升细胞悬浮培养液中震荡培养，经筛选后，建立两个品种的广藿香悬浮细胞培养体系，其悬浮细胞每隔15 25天继代培养一次; 所说的愈伤组织培养基组成是在每升MS基本培养基中添加0. 02、. I毫克的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4 - 二氯苯氧乙酸简称2，4 -D，以下及权利要求书中均采用简称)、0.2^1. 0毫克的激动素(激动素简称KT，以下及权利要求书中均采用简称)、30克蔗糖和6.5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8 ；
所说的细胞悬浮培养液组成是在每升MS基本培养基中添加0.02、. I毫克的2，4 -D、0. 5^1. 5毫克的6 -苄基氨基嘌呤(6 -苄基氨基嘌呤简称6 - BA,以下及权利要求书中均采用简称)和30克蔗糖，pH为5. 7 5. 8 ；
(2)原生质体的制备从继代培养3 15天的广藿香悬浮细胞培养体系中取一定体积的悬浮液，经离心得到沉淀的密实细胞，将密实细胞与酶解液按细胞密实体积酶解液体积比为I : 10 25的比例混合，在26±1°C，置低速摇床上以转速30 50转/分黑暗酶解8 12小时；
所说的酶解液组成是用原生质体洗涤液配制，其中含质量体积百分比为0. 5^1% (w/v)的果胶酶、0. 2% (w/v)的离析酶和0. 8 2. 5% (w/v)的纤维素酶，pH5. 7,用0. 2微米的过滤器过滤除菌所得；
所说的原生质体洗涤液组成是用5 13克甘露醇、0. I克2-吗啉乙磺酸(2-吗啉乙磺酸简称MES，以下及权利要求书中均采用简称)和0. 02、. 5克氯化钙混合，溶解于80ml的 水中，调整pH为5. 7,最后加水定容至100ml,用0. 2 ii m的过滤器过滤除菌所得；
(3)原生质体的分离纯化采用沉降法，在酶解结束后，依次用200目、400目不锈钢滤网过滤除未解离的细胞团，滤液以转速500转/分钟离心5分钟，沉淀用原生质体洗涤液洗涤2次，每次以转速500转/分钟离心3分钟，沉淀的原生质体用5 10倍体积的原生质体培养液悬浮，500转/分钟离心3分钟，沉淀为高纯度的原生质体，再次用原生质体培养液悬浮备用；
所说的原生质体培养液组成是在每升MS基本培养基中添加0. 05、. 5毫克的2，4-D、
0.5 2. 0毫克的6-BA、50 130克甘露醇和I克MES, pH为5. 7 5. 8 ；
所说的原生质体洗涤液的配制方法同步骤(2)；
(4)受体原生质体的处理以一个品种的广藿香原生质体作受体，取0.I毫升原生质体加入I. 5mM的碘乙酰胺溶液I毫升，静置15 18 min,将处理后的混合液用原生质体洗涤液洗涤2 3次，然后用原生质体培养液将处理过的原生质体稀释到IO5IO6个/ ml ;
所说的原生质体洗涤液的配制方法同步骤(2)；
所说的原生质体培养液的配制方法同步骤(3)；(5)供体的原生质体的处理取其另一个品种的广藿香原生质体作供体，用原生质体培养液稀释到浓度为10卜106个/毫升，加入培养皿中，在紫外灯下照射6(T180秒；
(6)聚乙二醇诱导融合将处理后的受体原生质体和供体原生质体按I: I的体积比混合后取I. O ml加到培养皿中，使之形成均匀的悬液，静置20分钟后，在此原生质体悬液的边缘均匀地滴加200 u I浓度的聚乙二醇溶液，静置20分钟促进原生质体融合；然后在原生质体悬液边缘滴加钙液400 ii I,静置15分钟促进融合，用原生质体洗涤液洗涤一次，然后加入原生质体培养液混匀，调整融合后的原生质体密度为每毫升IO5IO6个；
所说的聚乙二醇溶液组成是含2% (w/v)葡萄糖、I. 5% (w/v)硝酸钙和25 50%(w/v)的聚乙二醇(聚乙二醇简称PEG，以下及权利要求书中均采用简称)的水溶液，pH7. 0 ；所说的钙液是含4. 5% (w/v)硝酸钙的水溶液，pH7. 0 ；
(7)融合产物的看护培养取生长旺盛的广藿香悬浮细胞，用60目的不锈钢筛网滤除大的细胞团，滤液离心2分钟(1000转/分钟)，取沉淀的小细胞团作为看护细胞，将2ml此看护细胞与8ml浓度加倍的看护培养基混合,使细胞浓度达到体积百分比无15 20%(v/v)；将此看护细胞溶液与等体积的浓度为I. 2% (w/v) pH5. 6^5. 8的琼脂糖溶液混匀，倒入灭菌平皿中，待凝固后，在其上覆盖一层无菌的混合纤维素滤膜，将步骤(6)的融合产物接种到滤膜上，在26±1°C黑暗条件下培养，直到融合产物长成肉眼可见的细胞团；
所说的看护培养基的配制同步骤(I)中的细胞悬浮培养液并添加0. 6% (w/v)的
琼脂糖；
所说的浓度加倍的看护培养基组成是每升MS基本培养基中添加0. 04、. 2毫克的
2,4-D、I. 0-3.0 毫克的 6-BA 和 60 克蔗糖，pH 为 5. 7 5. 8 ;
(8)从融合产物细胞团诱导体胚发生将步骤(7)中获得的融合产物细胞团转移到体胚诱导培养基上，在26±1°C黑暗条件下培养，直到生成直径为I. (Tl. 5mm的成熟体胚；
所说的体胚诱导培养基组成是在每升MS基本培养基中添加0.5 2.0毫克的6-BA、
30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8 ；
(9)杂种体胚萌发与成苗将成熟体胚再转移到体胚诱导培养基上，每隔15 20天继代培养一次，直到体胚萌发得到再生苗，将高度为Hcm的再生苗转移到广藿香无菌苗生长培养基上进行培养，即可得到体细胞融合的杂种广藿香植株苗；
所说的广藿香无菌苗生长培养基组成是在每升MS基本培养基中添加30的蔗糖和
6.5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8。为了更好地实现本发明，步骤(I)悬浮细胞的培养中广藿香叶片是取石牌广藿香或海南广藿香的无菌苗顶芽下第2 3对展开叶片接种到愈伤组织培养基上诱导出愈伤组织，愈伤组织每次继代培养的时间为20天，愈伤组织接种于细胞悬浮培养液中的接种量为6克/ 100毫升，悬浮细胞每次继代培养的时间是15 18天；
所说的愈伤组织培养基组成为在每升MS基本培养基中添加0. 05毫克的2，4-D、0. 5毫克的KT,30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8 ；
所说的细胞悬浮培养液组成在每升MS基本培养基中添加0. 05毫克2，4-D和I. 0毫克的6-BA及30克蔗糖，pH为5. 7 5. 8。步骤(2)所说的酶解液组成是将0. 5% (w/v)的果胶酶、0. 2% (w/v)的离析酶和I. 0% (w/v)的纤维素酶溶解于含9% (w/v)甘露醇、0. 1% (w/v) MES和0.2% (w/v)氯化钙，pH5. 7的水溶液中配制而成。步骤(3)原生质体的分离纯化中，所说的原生质体培养液组成是在每升MS基本培养基中添加0. 05毫克的2，4-D和I. 0毫克的6-BA、70克甘露醇和I克MES。步骤(5)所说的紫外灯的功率为40瓦，距离培养皿50厘米，照射时间为6(T80秒，照射强度为500 iiW/cm2。步骤(6)所说的聚乙二醇溶液组成是含2% (w/v)葡萄糖、I. 5% (w/v)硝酸钙和40% (w/v)的分子量为6000的PEG的水溶液，pH7. O。步骤(8)所说的体胚诱导培养基组成是在每升MS基本培养基中添加I. 0毫克的6-BA、30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8。本发明有以下优点 I、本方法获得的广藿香杂种是与现有的广藿香品种不同的新品种。2、本方法在原生质体融合过程中采用的是不对称的融合方式，即融合产物中具有全套的受体原生质体的遗传物质和供体原生质体的部分遗传物质，所获得的杂种植株为不对称杂种，该杂种可以克服作为供体的品种不良性状，通过筛选可以得到具有供体和受体优良性状新品种，即该杂种结合了石牌广藿香和海南广藿香的品种优势，具有优质、高产的特点。3、本方法对受体原生质体和供体原生质体在融合前分别用碘乙酰胺和紫外光进行失活处理，使之在单独培养时都不能发育成苗，而只有融合产物因为结合了两者的遗传物质才能够再生植株，因此，所获得的再生植株绝大多数为杂种，可减少培养过程中的工作量，简化后期对杂种的筛选和鉴定工作。4、该品种没有引入任何外源基因，不存在生物安全性问题；该技术使用过程中对环境无污染。


图I为广藿香新品种的培育流程图。

愈伤组织培养基在每升MS基本培养基中添加0. 05或0. 02或0. I毫克的2，4_D、0. 2或0. 5或I. 0毫克的KT,30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8。细胞悬浮培养液在每升MS基本培养基中添加0.02或0.05或0. I毫克的2，4_D和0. 05或I. 0或I. 5毫克的6-BA，并添加30克蔗糖，pH为5. 7 5. 8。原生质体洗涤液用5或9或13克的甘露醇与0. I克MES、0. 2或0. 02或0. 5克氯化钙混合，溶解于80ml的水中，调整pH为5. 7，最后加水定容至100ml，用0. 2 y m的过滤器过滤除菌后使用。酶解液用原生质体洗涤液配制，其中含0. 5%或0. 8%或l%(w/v)的果胶酶，0. 2%(w/v)的离析酶和0. 8%或I. 5 %或2. 5% (w/v)的纤维素酶，pH5. 7，用0. 2微米的过滤器过滤除菌，或取0. 5% (w/v)的果胶酶,0. 2% (w/v)的离析酶和I. 0 % (w/v)的纤维素酶溶解于含9% (w/v)甘露醇、0. 1% (w/v) MES和0. 2% (w/v)氯化钙，pH5. 7的水溶液中配制而成。原生质体培养液在每升MS基本培养基中添加0. 05或0. 2或0. 5毫克的2，4_D和0. 5或I. 0或2. 0毫克的6-BA，并添加50或70或130克甘露醇和I克MES，PH为5. 7 5. 8。碘乙酰胺溶液用原生质体洗漆液溶解1225mg的碘乙酰胺,最后定容至IL，为5mM的碘乙酰胺母液；用原生质体洗涤液将此母液按所需浓度进行稀释，得到2. 5 mM,
I.5mM, I. OmM, 0. 5mM,0. 25mM 等浓度的碘乙酰胺。PEG 溶液含 2% (w/v)葡萄糖、I. 5% (w/v)硝酸I丐和 25% 或 40% 或 50% (w/v)的PEG (分子量为6000)的水溶液，pH7. O。
钙溶液含4. 5% (w/v)硝酸钙的水溶液，pH7. O。看护培养基同细胞悬浮培养液的配制，并添加0. 6%的琼脂糖。体胚诱导培养基在每升MS基本培养基中添加0. 5或I. 0或2. 0毫克的6_BA、30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为5. 7 5. 8。无菌苗生长培养基在每升MS基本培养基中添加30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，pH为 5. 7 5. 8。上述培养液和培养基均为高压灭菌(121 °C，0. IMPa下灭菌20分钟)后使用。试验例I石牌广藿香悬浮细胞的培养
以石牌广藿香的无菌苗顶芽下第3对叶片为外植体，将叶片剪切成I配方厘米左右的小块，接种在愈伤组织培养基上，黑暗培养，诱导出愈伤组织；愈伤组织经两次继代培养后，变得较为松散，取松散的广藿香的愈伤组织接种于细胞悬浮培养液中，6天后，依次用40目和100目的不锈钢网筛滤除未分散的愈伤组织团块，培养20天，建立石牌广藿香悬浮细胞培养体系。悬浮细胞每18天继代培养一次。A、试验不同的愈伤组织培养基对石牌广藿香愈伤组织生长的影响，所试验的培养基是在每升MS基本培养基中添加30克蔗糖和6. 5克琼脂粉，及不同量的2，4-D和KT的，pH为5. 7 5. 8，结果见表1，
表I不同愈伤组织培养基对愈伤组织诱导的影响


广藿香新品种的培育方法，属于药用植物组织培养育种方法，是利用原生质体融合技术获得新品种的方法，它采用悬浮细胞酶解法、沉降法分离纯化得原生质体，将受体的原生质体用碘乙酰胺处理，供体的原生质体用紫外线照射后用聚乙二醇诱导进行不对称融合,得到的融合产物置于看护培养基中进行看护培养，获得的细胞团转移到体胚诱导培养基进行培养诱导出体胚直至获得完整的再生苗，将再生苗再转移到促进植株发育的培养基中培养获得新品种，用本方法培育出具有石牌广藿香的有效成分广藿香酮高含量的优良品质，又具有海南广藿香的高产量的优质广藿香新品种，为广藿香种植业提供优质高产的种源，也为中药生产企业提供了新的药源。