一种疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法 【技术领域】，具体涉及一种疫苗组合物，以及其制备方法 和应用。 [0002] 鸡新城疫（newcastle disease，ND)具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发 生，且一旦爆发将给养禽业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列 为A类疫病。 [0003] 鸡传染性支气管炎（Infectious Bronchitis，IB)感染可导致雏鸡、肉鸡发育缓 慢，产蛋鸡产蛋减少和蛋品质下降等。OIE将其列为B类疫病。 [0004] 禽流感（H9 亚型）（Avian Infectious H9subtype)是由禽流感病毒（Avian Infectious Virus)引起的、主要流行于动物和人类中一种传染性、死亡率高的急性、高度 传染性疾病，广泛发生于世界各地，对人类和养禽业危害很大。 [0005] 鸡传染性法氏囊病毒（Infectious bursal disease virus, IBD)是由双RNA病毒 科中的传染性法氏囊病病毒引起的一种特殊疾病，损害幼鸡法氏囊。特征是腹泻、衰竭，法 氏囊先发生显著炎症和增大，继之以萎缩，最后患鸡死亡。该病除造成一些雏鸡死亡外，还 常引起病愈鸡免疫抑制，导致免疫接种失败，增加雏鸡对鸡新城疫等许多疾病的易感性。
[0006] 国内外现在上市的商品化产品品种很多，但都是很单一的传统疫苗，多次使用疫 苗尤其是灭活疫苗，不仅增加鸡场人力和物力负担，同时多次抓鸡的应激反应，还会影响生 产性能，致使鸡群对疾病的易感性增大。加之近年来H9亚型禽流感毒株的不断变异，使得 虽然推出的多种选择的疫苗，但仍然出现控制不住疫情发展的局面。
[0007] 同时，近几年的H9亚型禽流感毒株已发生变异，以前分离的毒株对新流行毒株的 保护力有限。



[0008] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种新的鸡新城疫、禽流感、传染性支气管 炎、法氏囊疫苗组合物，对现在流行的4种疫病达到较好的保护效果。
[0009] 本发明的主要目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量 的鸡新城疫病毒抗原、传染性支气管炎病毒抗原、H9亚型禽流感病毒抗原以及传染性法氏 囊病毒抗原。
[0010] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的 全病毒抗原或亚单位抗原；所述的传染性支气管炎病毒抗原为活的全病毒抗原、减毒的全 病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述的H9亚型禽流感病毒抗原为活的全病毒 抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；以及所述的传染性法氏囊病毒 抗原为活的全病毒抗原、减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原。
[0011] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原为灭活的La Sota株全病毒抗原，所述的传染性 支气管炎病毒抗原为灭活的M41株全病毒抗原，所述的H9亚型禽流感病毒抗原为灭活的SZ 株全病毒抗原，以及所述的传染性法氏囊病毒抗原为传染性法氏囊病毒成都株VP2蛋白。
[0012] 禽流感病毒（H9 亚型）SZ 株（Avian inf luenza virus (H9subtype) strain SZ)生 物保藏号是：CCTCC NO :V201240,保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC);保藏地址：中 国武汉?武汉大学，保藏日期：2012年9月16日。
[0013] La Sota株、M41株购于北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所。
[0014] 优选地，所述的鸡新城疫病毒抗原含量为彡108_°EID5(l/0. 1ml，所述的鸡传染性 支气管炎病毒抗原含量为彡106_°EID5(l/0. lml，所述的H9亚型禽流感病毒抗原含量为 > 108_°EID5(l/0. lml，所述的传染性法氏囊病毒抗原含量为琼脂扩散效价> 1:16。
[0015] 优选地，所述疫苗组合物进一步包括佐剂。
[0016] 本发明的另一目的在于提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括免疫量 的H9亚型禽流感病毒SZ株抗原，所述的H9亚型禽流感病毒SZ株抗原为活的全病毒抗原、 减毒的全病毒抗原、灭活的全病毒抗原或亚单位抗原；所述H9亚型禽流感病毒SZ株生物保 藏号是：CCTCC NO :V201240。
[0017] 优选地，所述H9亚型禽流感病毒SZ株抗原为灭活的全病毒抗原；所述H9亚型禽 流感病毒SZ株灭活的全病毒抗原含量为10 6_ 5EID5tlA). Iml?108_ 5EID5tlA). lml。
[0018] 优选地,所述H9亚型禽流感病毒SZ株疫苗组合物进一步包括佐剂,所述佐剂包括 油佐剂。
[0019] 本发明的再一目的在于提供一种疫苗组合物的制备方法，其中，所述方法包括： (1)分别培养增殖所述鸡新城疫病毒、所述的传染性支气管炎病毒、所述的H9亚型禽流感 病毒，表达所述的传染性法氏囊病毒VP2蛋白；（2)分别灭活所述培养增殖的鸡新城疫病 毒、传染性支气管炎病毒和H9亚型禽流感病毒，收集所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋 白；以及（3)将灭活的所述鸡新城疫病毒全病毒抗原、传染性支气管炎病毒全病毒抗原、H9 亚型禽流感病毒全病毒抗原和所述表达的传染性法氏囊病毒VP2蛋白混合，加入佐剂。
[0020] 优选地,所述步骤（3)中各抗原量之间比例为1:1:1:1?1:1:1. 2:1. 2 ;所述佐剂 包括硬脂酸铝油佐剂。
[0021] 本发明的还一目的在于提供一种疫苗组合物在制备预防和治疗鸡新城疫病毒、传 染性支气管炎病毒、H9亚型禽流感病毒以及传染性法氏囊病毒感染的疾病的药物中的应 用。
[0022] 本发明通过制备鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病的四 种抗原，并进行合理复配制成鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法氏囊病 四种疫病油乳剂疫苗，可以有效预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9亚型禽流感、传染性法 氏囊病的发生，同时也可以大大减少人们的劳动强度，降低养禽业养殖户的风险，保证公众 食品安全。
[0023] 本发明的四联苗技术的具有以下特点和优点：
[0024] (1)选育的新毒株经过血清学、分子生物学等试验进行大量的临床病料分析鉴定 工作，最后选出了一株较理想的制苗用毒株，该毒株HA效价高、免疫原性好并能抵御H9亚 型各地方流行毒株攻击。
[0025] (2)在传统全病毒灭活疫苗的基础上结合基因工程亚单位疫苗的复配，用于表达 传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白的重组菌株是用分子生物学的方法克隆的一株在我国流 行的IBDV超强毒株成都株的VP2基因，可表达传染性法氏囊病病毒的VP2蛋白，提取VP2 蛋白制备成疫苗，免疫效果好、生产工艺操作简单、生产成本低、纯度高、使用安全，跟以往 的制苗过程不一样，并且将传统全病毒灭活疫苗的基础上结合了基因工程亚单位疫苗的复 配，同时保证各单一病毒在联苗中均有和单苗一样效果。
[0026] (3)本发明对H9亚型禽流感病毒的繁殖工艺进行了摸索，确定了病毒的最适繁殖 工艺，缩短了病毒繁殖时间，同时提高了病毒滴度。在疫苗制备过程中，大大缩短了病毒液 生产时间，同时，较高的病毒滴度降低了生产成本，利用美国进口的Mi 11 ipore浓缩机将抗 原经过超强浓缩，抗体产生快，效价高，保护期长，降低疫病的发生及蔓延。
[0027] 序列表中：
[0028] 序列1为禽流感病毒H9亚型SZ株HAl基因序列；
[0029] 序列2为IBD成都株VP2基因序列。


[0030] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0031] 实施例I H9亚型禽流感病毒SZ株对现有流行株的交叉保护试验
[0032] 1.方法
[0033] 从2012?2013年分离株中选取4株病毒，对SZ株灭活疫苗的免疫效力进行比较。 毒株具体信息见下表1。
[0034] 表1 4株禽流感分离株的详细信息
[0035]