将核酸进行测序之组合物与方法_傅祖儒专利（测序,核酸,组合）-早鸽网

将核酸进行测序之组合物与方法

专利名称

将核酸进行测序之组合物与方法
发明者

傅祖儒, 张上嘉, 潘诏智, 范振业, 邱创汎
公开日

2012年11月14日
申请日期

2011年6月1日
优先权日

2010年6月2日
申请人

财团法人工业技术研究院
文档编号

C12Q1/68GK102782159SQ201180012142
关键字

测序核酸组合进行
权利要求

1.一种测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步骤 (a)提供一反应复合物，包括，ー模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的ー序列，与一聚合酶酶或ー酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性； (b)使该反应复合物与复数个核苷酸类似物接触，其中该复数个之ー个别的核苷酸类似物包括至少ー碱基配对部分与至少ー标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，其为指出该碱基配对部分的身份； (c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使该酶或酶复合物得以将ー核苷酸类似物以ー模板依赖方式并入一新生股，藉此将该标记部分结合至该新生股； (d)侦测该经并入之核苷酸类似物的该光可侦测标记； (e)藉由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以从该新生股移除该经并入之核苷酸类似物的该标记部分；以及 (f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸序列的序列2.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该光可侦测标记为一突光团3.根据权利要求2所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该核苷酸类似物还包括至少ー荧光淬熄部分，且其中在该核苷酸类似物藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性并入该新生股之时该荧光淬熄部分从该核苷酸类似物被移除4.根据权利要求I所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少ー碱基配对部分，具有一 5’端与一 3’端,包括一或多个核苷酸残基其各包括ー碱基,该碱基具有在该反应复合物之一反应位置中与该目标核酸序列之一对应碱基碱基配对的能力5.根据权利要求4所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该碱基配对部分之3’端为藉由一磷酸连接连结至该标记部分6.根据权利要求5所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该标记部分包括一光可侦测标记与一可选的连接物其连结该光可侦测标记至该磷酸连接7.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法,其中该标记部分还包括 (a)—或多个非互补核苷酸残基；以及 (b)一可选的连接物连结该光可侦测标记至该一或多个非互补核苷酸残基8.根据权利要求7所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法,其中该ー或多个非互补核苷酸残基为独立地择自ー无碱基核苷酸残基与包括一碱基之一核苷酸残基，而该碱基实质上缺乏与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一个碱基配对的能力9.根据权利要求3所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该荧光淬熄部分为附着至一核苷酸类似物的5’端10.根据权利要求9所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该荧光淬熄部分为藉由一连接物附着至一核苷酸类似物的5’端11.根据权利要求9所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该核苷酸类似物为ー核苷酸三磷酸盐类似物，其具有一 a磷酸盐、一 3磷酸盐与一 Y磷酸盐，且其中该荧光淬熄部分为附着至在该核苷酸类似物之5’端之三磷酸盐基团的该3或Y磷酸盐12.根据权利要求4所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分(a磷酸盐)的磷酸盐基团为ー硫代磷酸盐13.根据权利要求4所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分(a磷酸盐)的磷酸盐基团为一甲基磷酸盐14.根据权利要求4所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该至少一碱基配对部分包括至少三个磷酸盐基团于其5’端，其中最接近该碱基配对部分(a磷酸盐)的磷酸盐基团为ー硼烷磷酸盐15.根据权利要求I所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，介于在该反应复合物之活性位置之该核苷酸类似物的结合与从该新生股之标记部分的移除之间的时间长度为从50至250毫秒16.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为从约0.2秒至I秒的条件下17.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为从0.2秒至0.6秒的条件下18.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该方法被执行于，藉由介于两个连续之侦测步骤(d)之间的时间长度为自0.3秒至0.5秒的条件下19.根据权利要求I所述的測定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中在步骤(f)中重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸的序列包括持续监测与记录在要被依序并入该引物股之核苷酸类似物之该标记部分中的各光可侦测标记的依序并入20.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法,其中各核苷酸类似物包括 (a)于该核苷酸类似物的5’端,ー碱基配对部分包括一或多个核苷酸残基,其各包括ー碱基，该碱基为具有在该反应复合物之一活性位置中与目标核酸序列之一对应碱基碱基配对的能力，以及 (b)于该核苷酸类似物的3’端，ー标记部分视需要而定包括一或多个非互补核苷酸残基，其之各个实质上缺乏与该目标核酸序列之一对应的碱基碱基配对的能力21.ー种化合物，其具有式(I)O /0 O (* ^i I * 1 O 4XR2 /n Y1 A式⑴n > r 或一其药学上可接受之盐类或水合物，其中n 为 1、2、3、4、5、6、7、8 或 9 ；R1与各个R2为择自0_与！~L「Q，其中 (I)R1与各个民为0_;或 (Ii)R1为I~~L厂Q且各个R2为0_ ;或 (iii)R1为0_，ー个R2为ILfQ且任何剩余之R2独立地为0_、S_、BH3_或CH3 ； R3为ー核苷酸部分，其包括ー荧光染料F ； R4为H、0H、卤素(包括氟、氯、溴与碘)、烷基(包括CH3、CH2CH3)或烷氧基(经取代与未经取代两者)(包括OCH3与OCH2CH3)； Y1与Y3为各自独立地择自O、S—、BH3-与CH3 ； L1为择自烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、酷、胺基与磺酰基； Q为ー荧光淬熄部分；以及 B1为择自腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、次黄嘌呤与5-甲基胞嘧啶22.根据权利要求21所述的化合物，其中R3为择自23.根据权利要求21所述的化合物，其中R3为择自24.根据权利要求22所述的化合物，其中n为I，R1为I~い一且R2为0_25.根据权利要求22所述的化合物，其中Y1为26.根据权利要求22所述的化合物，其中R3为I广ろ27.根据权利要求22所述的化合物，其中R3为28.根据权利要求22所述的化合物，其中Y3为(F29.一种测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，包括步骤 (a)提供一反应复合物，包括，ー模板核酸，其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的ー序列，与一聚合酶酶或ー酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；(b)使该反应复合物与根据权利要求21所述的化合物接触； (c)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使得使该酶或酶复合物得以将根据权利要求21所述的化合物并入一新生股，藉此将基团F结合至该新生股； (d)侦测该基团F，其为指出碱基B1与视需要而定存在之碱基B2的身份与顺序； (e)藉由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以移除位于经并入之核苷酸残基之3’位置的该F基团，该经并入之核苷酸残基具有碱基B1与视需要而定存在之碱基B2 ；以及 (f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸序列的序列30.根据权利要求I所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法,其中该复数个核苷酸类似物包括至少四种类型的核苷酸类似物，各种类型包括一独特之碱基配对部分与一独特之荧光团，该荧光团为可与其它类型之该复数个之核苷酸类似物的荧光团区別31.根据权利要求30所述的测定一目标核酸序列之核苷酸序列的方法，其中该复数个核苷酸类似物还包括一核苷酸类似物，其具有ー荧光淬熄部分，该荧光淬熄部分在该核苷酸类似物并入该新生股之时从该核苷酸类似物被移除32.一种测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，该方法包括步骤 (a)执行ー核酸聚合反应，其利用一聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性两者，且以ー模板依赖方式导致一新生股的产生，其中执行该反应于下列存在时 (i)ー模板核酸，包括一目标核酸序列， (ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的ー序列； (iii)一聚合酶酶或ー酶复合物，包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性； (iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之ー个别的核苷酸类似物包括至少ー碱基配对部分与至少ー标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记；以及 (b)侦测该光可侦测标记，其中该标记为指出该碱基或存在于藉由该酶或酶复合物并入该新生股之该核苷酸类似物中之碱基的身份33.根据权利要求32所述的測定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，其中于各个依序的核苷酸并入事件中执行该侦测步骤，该核苷酸并入事件系在籍由该酶或酶复合物之3’至5’外核酸酶活性来移除于先前并入事件中所并入之该核苷酸类似物的光可侦测标记之后34.一种测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，该方法包括步骤 (a)执行ー核酸聚合反应于下列存在时 (i)ー模板核酸，包括一目标核酸序列， (ii)一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的ー序列； (iii)一聚合酶酶或ー酶复合物，包括用于以ー模板依赖方式并入ー核苷酸类似物的一反应位置； (iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之ー个别的核苷酸类似物包括至少ー碱基配对部分与至少ー标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，且其中一旦该类似物藉由该聚合酶酶或酶复合物以ー模板依赖方式被并入该新生股，该类似物不终止一新生股之产生，且其中相较于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性被移除的一标记的一核苷酸类似物，该核苷酸类似物提供至少ー个经延长之侦测期间与经延长之中介脉冲持续期间；以及 (b)侦测在各个依序并入事件中所并入之该标记部分35.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中相对于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物的5’至3’聚合活性来移除之一标记的ー类似物的侦测期间，该侦测期间以至少10倍被延长36.根据权利要求34所述的測定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中两个连续之侦测步骤被以约0. 2至约I秒分隔37.根据权利要求34所述的测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中该核苷酸类似物还包括至少ー荧光淬熄部分，且其中该荧光淬熄部分在该核苷酸类似物藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性并入该新生股之时从该核苷酸类似物被移除38.根据权利要求34所述的測定一目标核酸序列之核酸序列的方法，其中藉由该酶或酶复合物经由其5’至3’聚合活性来移除该标记部分39.根据权利要求1、32或34项之任一项所述的方法，其中该目标核酸序列包括序列重复40.根据权利要求1、32或34项之任一项所述的方法，其中该目标核酸序列包括一或多个序列重复，其择自(A)n、(T)n、(C)n或(G)n，其中n为3或更大之整数
技术领域

本发明系关于测定一核酸之序列的方法此外，本发明关于核苷酸类似物与其在一核酸测序中的用途
背景技术

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权力要求
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法律状态

专利名称：将核酸进行测序之组合物与方法已发展出各种技术与程序来获得基因信息，包括在基因密码(genetic codes)中之分离标志的广泛的基因剖析研究或鉴定形态(broad genetic profiling oridentifying pattern)与整个基因体的核苷酸程度之测序。对于在多种应用领域，例如生物技术、鉴识生物学(forensic biology)、诊断(diagnostic)、系统生物学(systematicbiology)、合成生物学(synthetic biology)与个人健康照顾(personal healthcare)中的基础生物学研究而言，DNA序列的知识已变成不可缺少。DNA测序的出现已显著地增进了生物学研究与发现。尽管技术已发展至在核苷酸程度读取一基因序列，但此类方法可为费时且极度昂贵的。藉由从电泳基础方法转移至芯片基础测序，新世代测序(Next GenerationSequencing)之最新的技术(于 Metzker, M. L.，NATUREREVIEWS GENETICS 11:31-45(2010)中回顾)，已大幅降低测序之成本，其不是自经扩增之目标分子的族群得到序列信息，而通常包括将单一目标分子进行测序。实时测序的引入，其中监测连续核苷酸并入事件的发展，同时执行核酸聚合程序，已改善了测序的效率。实时单一分子测序的一般策略为源自焦磷酸测序(pyrosequencing)的概念，其中以一光可侦测标记来标记核苷酸三磷酸盐单体的PPi部分。在焦磷酸测序反应中，当各单体被并入一增长之链时，即在聚合酶扩展(polymerase extension)期间，光讯号被释放且侦测(参见，例如 Ronaghi, et al.，SCIENCE, 281:363-365 (1998) ;Hyman, ANAL.BI0CHEM.，174:423-436(1988);与美国专利号 6，255，083 与 7，329，492)。使用零阶波导(zero-mode waveguide, ZMW)以在单一分子测序中增加讯号对噪声比(signal-to-noiseratio)之单一分子侦测的方法也已被描述于美国专利号7，170, 050与7，056, 676中。在任何酶居中(enzyme-mediated)、模板依赖(template-dependent)测序程序中，并入程序的整体精确度、持续性(processivity)与正确性可直接影响序列测定。目标序列读取之较低的正确性可能需要多倍覆盖率(multiple-fold coverage)以测定出一具有高程度的信赖度之目标序列。不论近来之发展，存在着对每个测序反应提供较高之正确性之测序策略的需要。
于此提供之实施例提供用于扩大单一分子讯号侦测之观察期间以改善单一分子序列测定的正确性的新颖方法。实施例包括一测定一目标核酸之核苷酸序列的方法。在一些实施例中，方法包括步骤(a)提供一反应复合物,包括,一模板核酸,其包括一目标核酸序列、一引物核酸，其包括与该模板核酸之一区域互补的一序列，与一聚合酶酶或一酶复合物，其包括5’至3’聚合活性与校对之3’至5’外核酸酶活性；(b)使该反应复合物与复数个核苷酸类似物接触，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，其为指出该碱基配对部分的身份；(C)藉由该酶或酶复合物之5’至3’聚合活性，使该酶或酶复合物得以将一核苷酸类似物以一模板依赖方式并入一新生股(nascent strand),藉此将该标记部分结合至该新生股；(d)侦测该经并入之核苷酸类似物的该光可侦测标记；(e)藉由该酶或酶复合物之校对之3’至5’外核酸酶活性，使该酶或酶复合物得以从该新生股移除该经并入之核苷酸类似物的该标记部分；以及(f)重复步骤(c)-(e)以测定该目标核酸的序列。于此描述之方法包括一种测定在一核酸聚合反应中藉由一聚合酶酶或酶复合物所并入之一核苷酸碱基的方法，该方法包括步骤(a)执行一核酸聚合反应，其利用一聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性两者，且以一模板依赖方式导致一新生股的产生，其中执行该反应于下列存在时(i) 一模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii) 一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii) 一聚合酶酶或一酶复合物，包括5’至3’聚合活性与3’至5’外核酸酶活性；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记；以及(b)侦测该光可侦测标记，其中该标记为指出该碱基或存在于藉由该酶或酶复合物并入该新生股之该核苷酸类似物中之碱基的身份。实施例还包括一种测定一目标核酸序列之核酸序列的方法，该方法包括步骤(a)执行一核酸聚合反应于下列存在时Q) —模板核酸，包括一目标核酸序列，(ii) 一引物核酸，包括与该模板核酸之一区域互补的一序列；(iii) 一聚合酶酶或一酶复合物，包括用于以一模板依赖方式并入一核苷酸类似物的一反应位置；(iv)复数个核苷酸类似物，其中该复数个之一个别的核苷酸类似物包括至少一碱基配对部分与至少一标记部分，该标记部分包括一光可侦测标记，且其中一旦该类似物藉由该聚合酶酶或酶复合物以一模板依赖方式被并入该新生股，该类似物不终止一新生股之产生，且其中相较于包括藉由该聚合酶酶或酶复合物之5’至3’聚合活性被移除的一标记的一核苷酸类似物，该核苷酸类似物提供至少一个经延长之侦测期间与经延长之中介脉冲持续期间；以及(b)侦测在各个依序并入事件中所并入之该标记部分。于此叙述之任何测序方法中所使用的光可侦测标记可为一荧光团(fluorophore)或可藉由一光侦测器侦测之任何其它适合之标记。于此叙述之任何方法中所使用的核苷酸类似物可包括至少一突光淬熄部分(fluorescence quenching moiety) 在藉由酶或酶复合物之5’至3’聚合活性以一模板依赖方式并入核苷酸类似物之时，该荧光淬熄部分从该核苷酸类似物被移除。在一些方面中，荧光淬熄部分，视需要而定藉由一连接物(linker)，附着至一核苷酸类似物之5’端。在一些方面中，荧光淬熄部分附着至于核苷酸类似物之5’端之三磷酸盐基团的3或Y磷酸盐。在一些方面中，标记部分包括一光可侦测标记与一可选的连接物其连结光可侦测标记至一磷酸连接(phosphate linkage)。在一些其它方面中，标记部分包括(a) —或多个非互补核苷酸残基；(b) —光可侦测标记；以及(C) 一可选的连接物连结该光可侦测标记至该一或多个非互补核苷酸残基。该一或多个非互补核苷酸残基为独立地择自一无碱基核苷酸残基与包括一碱基之一核苷酸残基，而该碱基实质上缺乏与腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶之任一个碱基配对的能力。核苷酸类似物之碱基配对部分一般包括一碱基，该碱基具有在该反应复合物之一并入位置中与该目标核酸之一对应碱基碱基配对的能力。在一些方面中，碱基配对部分之3’端经由一磷酸连接连结至标记区域。在一些实施例中，碱基配对部分包括至少三个磷酸盐机团于其5’端，其中，最接近该碱基配对部分(a磷酸盐)的磷酸盐基团为一硫代磷酸盐(phosphorothioate)、甲基磷酸盐(methyIphosphonate)或硼烧磷酸盐(boranophosphate)。实施例还包括一化合物,具有式I :实施例系关于将核酸进行测序的方法。实施例包括核苷酸类似物与包括校对活性之一核酸聚合酶酶或酶复合物的用途。核苷酸类似物可变成被并入一复制之股并且诱发聚合酶的校对活性，因此延长了与核苷酸并入相关之讯号的持续期间，产生更显著的测序结果并增加核酸测序的正确性。

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