一种改进的亚硫酸盐测序方法[0002]对于生物DNA甲基化的研究，有很多报道，包括高效液相色谱法、亚硫酸盐测序法、甲基化敏感的限制性内切酶结合Southern杂交分析法和MSAP (methylation-sensitive ampIi fied polymorphism)法等(南楠，曾凡锁等)。高效液相色谱(HPLC)法是目前测定基因组DNA中5-mC总量最标准的方法，但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯度要求较高(周翠兰，殷宇芳等)。甲基化敏感的限制性内切酶联用Southern印迹杂交法，此法不能反映出整个CpG岛甲基化状态。亚硫酸盐测序(bisulfite DNAsequencing)，利用该方法时要注意DNA应被亚硫酸氢钠充分处理，有报道称靠近甲基化CpG位点的非甲基化胞嘧啶具有对亚硫酸氧钠的抵制作用(范保星)。关于基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰，大多参考Frommer等(1992)经典修饰方法(单存海，钟鸣等)。
[0003]本发明的目的是提供一种改进的亚硫酸盐测序方法。[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:[0005]一种改进的亚硫酸盐测序方法，将基因组DNA经酶切纯化，纯化后加入亚硫酸盐修饰液进行解链与修饰；修饰后纯化回收测序，即实现基因组DNA的测序；所述亚硫酸盐修饰液为 500-550ul、100-120 μ LNa0H、0.5-0.6mg 水溶性维生素 E (Trolox)、10-15 μ L 三烯丙基氰脲酸酯、0.037-0.040g四乙烯五胺五盐酸盐(TETRAEN)、37.5-40.0 μ L盐酸胍溶液、0.3422-0.3800g 偏重亚硫酸钠、20-30 μ L 对苯二酚和 100_120ul 无菌水；ΡΗ=5.0-5.1。[0006]将基因组DNA中加入EcoR I酶、Hind III酶、缓冲液以及无菌水于常温下水浴24-30h，经水浴酶切后加入酶切体系等体积的氯仿与异戊醇的混合液混匀后离心收集上清液；[0007]其中缓冲液为IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫苏糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0008]而后在上清液中加入其体积1/10-1/5的3M NaAC,40-60 μ g糖原和3.5-4倍所述上清液体积的预冷无水乙醇混匀后，于_20°C沉淀过夜培养；
[0009]过夜培养后离心收集沉淀，并在沉淀中加入预冷的无水乙醇间歇混匀，再离心收集沉淀，通风干燥后加入无菌水，待用。
[0010]所述经酶切纯化后DNA在93-95°C经PCR处理5_10min使其变为单链，将裂解液于冰中静止1-5分钟，离心5-6S后，加入NaOH混匀后于42_45°C水浴20_30min ;水浴后30 μ L裂解液中加入500 μ L亚硫酸盐修饰液混匀进行PCR处理修饰。在PCR仪器中95°C反应3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重复三遍，最后保存温度为20°C。
[0011]本发明具有如下优点:[0012]1.本发明所得亚硫酸盐修饰液时添加了催化剂和抗氧化剂(三烯丙基氰脲酸酯(TAC)、水溶性维生素E (Trolox)、四乙烯五胺五盐酸盐(TETRAEN)、盐酸胍溶液。从而缩短了测序方法的修饰时间，使修饰时间从16h缩短到1.5h ;同时加入Trolox具有抗氧化性质的试剂，可以预防过氧化亚硫酸盐导致的氧化胁迫；加入的盐酸胍水溶液具有变性蛋白功能，在后续PCR中，可以有效的防止蛋白的影响。
[0013]2.采用本发明测序方法所得基因组，提高了生物基因组DNA CG位点的转化率。
[0014]3.双链DNA在修饰之前需要变性，只有位于单链DNA上的甲基化胞嘧啶才能被亚硫酸氢钠转化，因此，DNA部分变性是引起假阳性常见的原因，要实现完全转化，温度和时间的控制至关重要。在原始的修饰方法中，55°C修饰12至16h，该条件下，大部分DNA的完整性要被破坏，大约有84% -96%的DNA被降解。之后进行PCR检测甲基化，有诸多缺点:首先，扩增CG含量高的启动子区域非常困难；其次，用亚硫酸氢钠处理后增加了后续PCR反应的难度，表现为:①处理后DNA大量减少，模板量少；②大量的脲嘧啶使DNA双链不能完全互补，不稳定性增加引物针对正义DNA链设计，相当于单链扩增，且引物易与模板错配，产生大量非特异性扩增产物。
[0015]采用本发明修饰时间只有约I小时30分钟，而且中间增加了三次95°C 30s的变性时间。此种修饰法，既大大缩短了修饰的时间，同时在保证完全修饰的基础上，有效的保护了 DNA的完整性。之后进行PCR扩增的稳定性和重复性均增加。



[0016]图1为采用经典修饰方法，甲基化位点图。对比标准可知，Cd浓度为0、0.5,5.0的胁迫，甲基化位点分别为5、5、4。如图所示(共11个CG位点，其中黑色的圆圈表示此位点发生甲基化)没有明显的变化趋势。
`[0017]图2为本发明实施例提供的采用改进的修饰方法，甲基化位点图。对比标准可知，Cd浓度为0、0.5,5.0的胁迫，甲基化位点分别为2、3、4。可以看出，随着Cd胁迫浓度的增加，甲基化程度呈上升趋势。如图所示(共11个CG位点，其中黑色的圆圈表示此位点发生甲基化)。
[0018]图3为本发明实施例提供的2%琼脂糖凝胶电泳图，其中从左到右的孔道依次为:CdO、Cd0.5、Cd5.0、markerDL2000o

[0019]实施例1
[0020]1.在约 IOyg 的基因组 DNA 中加入 10 μ L EcoR I 酶、10 μ L Hand III 酶和 20 μ L缓冲液，并加无菌水至200 μ L，于37°C水浴24小时，进行酶切处理。
[0021]所述其中缓冲液为IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫苏糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0022]2.首先水浴结束后，加入酶切体系等体积200ul的氯仿与异戊醇混合液，间歇混匀10分钟；然后于4°C，12000r/min离心IOmin,吸取上清液180 μ L转移到一新1.5ml离心管中。
[0023]其次加入上清液1/10体积的3M的NaAC (约20ul) ,40 Ug糖原和上清液3.5倍体积(650 μ L-700U1)的预冷的无水乙醇混匀后，于-20°c沉淀2— 3个小时(或过夜)；而后以4°C, 12000r/min 离心 30min。
[0024]弃上清液,在沉淀中加入Iml预冷的无水乙醇，间歇混匀5min ;再以4°C, 12000r/min离心20min ;所得沉淀再经预冷的无水乙醇混匀重复离心操作。
[0025]最后再将沉淀常温下离心8s，将附着在EP管内壁上的乙醇残液离至管底，用灭过菌的滤纸吸干沉淀周围的液体，通风干燥3min，时间不要太长，否则不易回溶。干燥后的DNA中加入50 μ L无菌水。
[0026]3.亚硫酸盐修饰液的配制:在2ml的离心管中，加入600 μ L无菌水，同时在加入100 μ L新配的6Μ Na0H、0.5mg水溶性维生素E (配好后终浓度是0.5mg/ml)、10 μ L三烯丙基氰脲酸酯(终浓度是lmM)、0.037g四乙烯五胺五盐酸盐(TETRAEN)(终浓度是0.1M)、37.5μ L盐酸胍溶液(终浓度是0.3Μ)、加入0.3422g偏重亚硫酸钠(终浓度是3.6M)和20 μ L新配的对苯二酚；调节PH为5.0-5.1，加入无菌水100 μ L，即定容到1ml。
[0027]所述6M NaOH的配制为:0.24g NaOH溶于Iml无菌水；同时现用现配。320mM对苯二酚的配制为:0.007g对苯二酚溶于200 μ L无菌水；并在锡箔包裹，避光，55°C下水浴保存待用。0.1M三烯丙基氰脲酸酯的配制:0.0034g三烯丙基氰脲酸酯溶于200 μ L无菌水。
[0028]4.将步骤3)酶切纯化后的DNA溶液25 μ L置于PCR仪中，在95°C处理5min使其变为单链；将上述单链DNA拿出，置于冰中I分钟，离心5-6S后，向管中加入5yL 6M的NaOH,用枪混匀，42°C下水浴20min (终体积30ul)。[0029]水浴结束后，向30 μ L解链后的DNA溶液中，加入上述步骤3)配制的亚硫酸盐修饰液修饰液500ul，此时总体积为530 μ L ;而后分装PCR管中，短暂离心之后进行修饰，修饰程序为:在PCR仪器中95°C反应3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重复三遍，最后保存温度为20°C。
[0030]5.将修饰后DNA的纯化回收使用洗脱纯化回收DNA系统进行纯化回收处理
[0031]具体为:1)修饰之后合管于1.5mLEP管中，管中加入200-250 μ L洗脱纯化回收DNA树脂，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合。Clean-up resin在使用前应剧烈摇匀，否则树脂沉降在溶液的底层，影响回收质量(洗脱纯化回收DNA系统，按照Wi zard? DNA纯化系统公司所提供系统进行，具体为Promega，A7280)。
[0032]2)将一只2.5mL医用注射器的针筒与试剂盒(购自Wizard? DNA纯化系统公司)提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用微量移液器移至针筒内，取一个小量度的玻璃烧杯放置在小柱下部以方便接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体缓慢挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
[0033]3)将注射器与小柱分尚后拔出针栓,再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2mL80%的异丙醇溶液，插入针栓，轻轻加压，将液体缓慢挤出。此为洗涤步骤。洗涤后再重复洗漆I次。
[0034]4)将注射器与小柱分离，将小柱置于一废弃1.5mL的EP管上，常温10000g/min(g是相对离心力，不是转速r)，离心2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合的状态。
[0035]5)将小柱取下置于另一洁净1.5mL EP管上，并用微量移液器吸取50 μ L事先70°C预热好的无菌水置于EP管，室温放置5min，常温10000g/min离心20s进而洗脱下小柱内经修饰的DNA溶液，洗脱过程重复操作2次(每次50ul，两次之后保证总体积是lOOul)。洗脱后EP管内修饰后DNA溶液终体积为100 μ L0
[0036]6.脱磺化:向上述100 μ L洗脱溶液中加入5 μ L新鲜配制的6Μ NaOH溶液，于42°C水浴20min。水浴后吸取160 μ L 4Μ的NH4AC加入其中，混匀，使溶液pH值稳定在8.0附近，进行脱磺化。(此步为脱磺化，终体积为265 μ L)。
[0037]脱磺化后加入其3倍体积(约800μ L)的_20 °C低温预冷的无水乙醇，再加入40 μ g糖原，后置于_20°C沉淀3小时(或过夜)。而后以4°C下12000r/min离心30min，倒去上清液，收集沉淀于EP管中并加入Iml异丙醇，轻柔倾斜EP管，旋转一圈，洗涤沉淀，后40C 12000r/min离心lOmin。而后再重复操作离心处理I次。
[0038]倒掉上清，在于常温离心8s，将附着在EP管内壁上的乙醇残液离至管底，用无菌滤纸条小心将残余液体吸净，并于室温下通风干燥3min。当沉淀由不透明变为透明时，用微量移液器加入60 μ L无菌水，溶解5-10min，此处即为修饰后的DNA溶液。
[0039]7.将上述修饰后DNA溶液进行met—PCR ;采用25 μ L体系。即DNA用量分别为150ng。PCR 体系成分为:2.5ul 10*buffer、2.0ul DNTP、0.5ul rTaq、0.8ul 引物和 150ngDNA(5ul)，加水至 25ul。
[0040]PCR 程序为:941:预变性51^11;941: 30s, 55。。30s, 72。。Imin 2 圈;采用降落 PCR，将退火温度每两圈降低一度。直至退火温度降低到47°C，将47°C退火设置为19圈，72°C延伸1Omin ;4°C中断，共计35圈。而后将扩增产物用常规克隆测序。
[0041]实施例2
[0042]1.提取基因组DNA:
[0043]首先用0.1% HgCl2溶液对选取好的饱满拟南芥种子进行IOmin表面消毒，然后用去离子水清洗3次，每次5min。洗净后，将种子浸泡于去离子水中，于4°C放置3d，以打破种子休眠。将相同数量的拟南芥种子(约20~30粒)置于灭菌后的三角瓶中，加入IOOmL分别含 0、0.5 和 5.0mg.L 1Cd (CdCl2 配制)的 MS 营养液(Murashige and Skoog BasalSalt Mixture)，密封。置于摇床中进行光照培养(温度19~20°C，光暗周期14/10h，光强30001x)，21d后取样，用刀片分离拟南芥幼苗叶及其根，经蒸馏水与无菌水分别清洗3次后用滤纸擦干，冷藏于_80°C冰箱中待用。
[0044]而后以CTAB法提取经不同浓度镉(0、0.5,5.0mg.l-1)胁迫的拟南芥幼苗基因组DNA (提取过程参见钟鸣马慧，2008，生物技术实验指导，北京:中国农业大学出版社，ISBN:9787811172768),
[0045]2.在约10 μ g的上述提取所得基因组DNA中加入10 μ L EcoR I酶、10 μ L HindIII酶和20 μ L M buffer,并加无菌水至200 μ L，于37°C水浴24小时，进行酶切处理。
[0046]所述其中缓冲液为IOOmM Tris-Hcl (pH7.5)、IOOmM MgCl2UOmM 二硫苏糖醇(Dithiothreitol)>500mM NaCl ；
[0047]3.首先水浴结束后，加入酶切体系等体积200ul的氯仿与异戊醇混合液，间歇混匀10分钟；然后于4°C，12000r/min离心IOmin,吸取上清液180 μ L转移到一新1.5ml离心管中。
[0048]其次加入上清液1/10体积的3M NaAC (约20ul)、40 μ g糖原和上清液3.5倍体积(650 μ L-700U1)的预冷的无水乙醇混匀后，于-20°c沉淀2— 3个小时(或过夜)；而后以4°C, 12000r/min 离心 30min。[0049]弃上清液,在沉淀中加入Iml预冷的无水乙醇，间歇混匀5min ;再以4°C, 12000r/min离心20min ;所得沉淀再经预冷的无水乙醇混匀重复离心操作。
[0050]最后再将沉淀常温下离心8s，将附着在EP管内壁上的乙醇残液离至管底，用灭过菌的滤纸吸干沉淀周围的液体，通风干燥3min，时间不要太长，否则不易回溶。干燥后的DNA中加入50 μ L无菌水。
[0051]4.亚硫酸盐修饰液的配制:在2ml的离心管中，加入600 μ L无菌水，同时在加入
100μ L新配的6Μ NaOH,0.5mg水溶性维生素E (配好后终浓度是0.5mg/ml)、10 μ L三烯丙基氰脲酸酯(终浓度是ImM)、0.037gTETRAEN(终浓度是0.1M)、37.5 μ L盐酸胍溶液(终浓度是0.3M)、加入0.3422g偏重亚硫酸钠(终浓度是3.6M)和20 μ L新配的对苯二酚；调节PH为5.0-5.1，加入无菌水100 μ L，即定容到Iml。
[0052]所述6Μ NaOH的配制为:0.24g NaOH溶于Iml无菌水；同时现用现配。320mM对苯二酚的配制为:0.007g对苯二酚溶于200 μ L无菌水；并在锡箔包裹，避光，55°C下水浴保存待用。0.1M三烯丙基氰脲酸酯的配制:0.0034g三烯丙基氰脲酸酯溶于200 μ L无菌水。
[0053]5.将步骤4)酶切纯化后的DNA溶液25 μ L置于PCR仪中，在95°C处理5min使其变为单链；将上述单链DNA拿出，置于冰中I分钟，离心5-6S后，向管中加入5yL 6M的NaOH,用枪混匀，42°C下水浴20min (终体积30ul)。
[0054]水浴结束后，向30 μ L解链后的DNA溶液中，加入上述步骤3)配制的亚硫酸盐修饰液修饰液500ul，此时总体积为530 μ L ;而后分装PCR管中，短暂离心之后进行修饰，修饰程序为:在PCR仪器中95°C反应3min，55°C 20min，之后95°C 30s, 55°C 20min重复三遍，最后保存温度为20°C。
[0055]6.将修饰后DNA的纯化回收使用Wizard Clean-up DNA (洗脱纯化回收DNA)系统进行纯化回收处理。
[0056]具体为:1)将上述修饰好的DNA合管于1.5mLEP管中，加入200-250 μ L WizardDNA Clean-up resin (洗脱纯化回收DNA树脂),轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合。(Clean-up resin在使用前应剧烈摇匀,否则树脂沉降在溶液的底层,影响回收质量)。
[0057]2)将一只2.5mL医用注射器的针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用微量移液器移至针筒内，取一个小量度的玻璃烧杯放置在小柱下部以方便接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体缓慢挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
[0058]3)将注射器与小柱分尚后拔出针栓,再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2mL80%的异丙醇溶液，插入针栓，轻轻加压，将液体缓慢挤出。此为洗涤步骤。洗涤后再重复洗漆I次。
[0059]4)将注射器与小柱分离,将小柱置于一废弃1.5mL的EP管上,常温10000g/min(g是相对离心力，不是转速r)，离心2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合的状态。
[0060]5)将小柱取下置于另一洁净1.5mL EP管上，并用微量移液器吸取50 μ L事先70°C预热好的无菌水置于EP管，室温放置5min，常温10000g/min离心20s进而洗脱下小柱内经修饰的DNA溶液，洗脱过程重复操作I次。洗脱后EP管内修饰后DNA溶液终体积为100 μ L。
[0061]7.脱磺化:向上述IOOyL洗脱溶液中加入5μ L新鲜配制的6Μ NaOH溶液，于42°C水浴20min。水浴后吸取160 μ L 4Μ的NH4AC加入其中，混匀，使溶液pH值稳定在8.0附近，进行脱磺化。(此步为脱磺化，终体积为265 μ L)。
[0062]脱磺化后加入其3倍体积(约800μ L)的-20 °C低温预冷的无水乙醇，再加入40 μ g糖原，后置于_20°C沉淀3小时(或过夜)。而后以4°C下12000r/min离心30min，倒去上清液，收集沉淀于EP管中并加入Iml异丙醇，轻柔倾斜EP管，旋转一圈，洗涤沉淀，后40C 12000r/min离心lOmin。而后再重复操作离心处理I次。
[0063]倒掉上清，常温离心8s，将附着在EP管内壁上的乙醇残液离至管底，用无菌滤纸条小心将残余液体吸净，并于室温下通风干燥3min。当沉淀由不透明变为透明时，用微量移液器加入60 μ L无菌水，溶解5-10min，此处即为修饰后的DNA溶液。
[0064]8.将上述修饰后DNA溶液进行met — PCR ;采用25 μ L体系。即DNA用量分别为150ng。PCR 体系成分为:2.5ul 10*buffer、2.0ul DNTP、0.5ul rTaq、0.8ul 引物和 150ngDNA(5ul)，加水至 25ul。
[0065]PCR 程序为:94°〇预变性51^11;941: 30s, 55。。30s, 72°C Imin 2 圈;采用降落 PCR，将退火温度每两圈降低一度。直至退火温度降低到47°C，将47°C退火设置为19圈，72°C延伸IOmin ;4°C中断，共计35圈；PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离(参见图3)
[0066]另，将上述所得PCR产物进行测序，将测序结果进行甲基化位点分析，重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，用不含任何CpG位点的引物进行PCR扩增，以免扩增时区别甲基化或非甲基化DNA。扩增后尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，根据碱基变化(CG位点发生甲基化的则仍为CG，未发生甲基化的则为TG)判断CpG位点是否发生甲基化。
`[0067]可见重金属Cd胁迫对拟南芥幼苗错配修复基因MutL-homologuel (MLHl)启动子甲基化的影响。(参见图2)
[0068]由图2与对比标准相比可知，Cd浓度为O、0.5、5.0的胁迫，甲基化位点分别为2、
3、4。可以看出，随着Cd胁迫浓度的增加，甲基化程度呈上升趋势。且CG位点的变化与Cd胁迫浓度有较明显的剂量效应关系。如图所示共11个CG位点，其中黑色的圆圈表示此位点发生甲基化。
[0069]9.将上述所得产物常规克隆测序，得到:
[0070]CGCACCAATGACTGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAAATTATAATTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAAAAAAATCATTTCTAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTAATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAAAAACTATAATAATCATAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAATATCATCAACTTTAATCCATCTATAAAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTT
TATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTA
TTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAT
TGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACAT
[0071]得出的Cd胁迫浓度为O的MLHl基因启动子的序列图谱
[0072]CCCACATGACTGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAMTTATAATTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAGAAAAATCATTTCTAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTAATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAGAGACTATAATAATCATAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAATATCGTCAACTTTAATCCATCTATAAAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCT
[0073]得出的Cd胁迫浓度为0.5的MLHl基因启动子的序列图谱
[0074]ATGGACATGATTACGCCAGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACGATTACCCAATTAAATTCTAAAAACCCACTAATAACCCAAATTTATTTAAAATTATACTTTATCATCATATATACCTTTTTCCTTTCCCTAAACTACAAAAAATCATTCATTATAAAAATTAAAACAATAACAACAATAATCTACAATCTTCCAAAAAATTTAATCAAAAAAATCATTTCCAAAATTCCTTTAAAATCTATAAAAACGATAAAATTAACTTACAAAACTTAAAACAATTTATCCAAAAATAAAAATTTTACGAAAATACACATTGATAAAATAACAACACCAACAAAAAATAAAGAAACTATAATAATCACAATAATACCTCACAAACTTTATTTAATAAACAGTATCGTCGACTTTAATCCATCTATAGAAATTAAAAATCAACTTTTCATTCACAATAATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGT
[0075]得出的Cd胁迫浓度为5.0的MLHl基因启动子的序列图谱。
[0076]实施例3
[0077]同时采用现有的原始亚硫酸盐测序进行同样测序Marianne Frommer (1992), Agenomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosineresidues in individual DNA strands, Proc.Nat1.Acad.Sc1.USA 89，1827-1831.)，(参见图1)
[0078]由图1与对比标准相比可知，Cd浓度为0、0.5、5.0的胁迫，甲基化位点分别为5、5、4。如图所示(共11个CG位点，其中黑色的圆圈表示此位点发生甲基化)没有明显的变化趋势。