专利名称：基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法高通量测序技术是对传统测序(Sanger测序)一次革命性的改变。传统测序技术一次只能测单ー的基因片段，在1990年-2003年首次完成的ー个人的全基+因组测序使用的就是传统的Sanger法，花费了十几年的时间，耗费了巨大的资金，动员了多个国家的数百科学家。而高通量测序可一次对几十万到几百万条甚至几千万条DNA分子片段进行序列測定，完成ー个人的基因组测序目前达到只需要几天的时间，成本降到几千美元。高通量测序一般称为下一代测序技木。高通量测序技术包括目前的Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和HiSeq技术、ABI公司的SOLiD技术、Life technologies 公司的 Ion torrent 测序技术、Helicos HeliscopeTM 和 PacificBiosciences推出的单分子测序技术，及将要出现的其它高通量测序技木。高通量测序技术应用前景很广，已经应用到各物种基因组全测序、表观基因组学、宏基因组学及功能基因组学研究的许多方面。虽然这些应用极大地増加了发现与人类疾病息息相关的各种基因突变、短片段插入/缺失、基因组水平异常的机会，但目前还主要停留在研究阶段，还没有作为临床诊断和检测手段，更没有对各种环境下的微生物种群及其比例关系进行鉴定。造成这种现状的主要原因一是现有高通量技术使用成本高，ニ是还没有一种基于高通量测序的定性定量方法。目前常用的核酸定性方法是做ー个PCR扩增，有产物产生就断定是某种DNA。这种方法虽然简单，但一次只能鉴定ー种DNA;又由于PCR非常灵敏，极易被污染造成假阳性結果。研究核酸定量的方法目前是real-time Q-PCR(荧光实时定量PCR)方法。所谓real-time Q-PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团或者荧光探针，利用荧光信号产生时的扩增循环位点(Ct值)与样品中靶标的量有对数关系，实时监测整个PCR进程中荧光信号的累积过程，最后通过与样品中另ー參照物或标准曲线进行比对的定量分析方法。因此，靶标定量有两种策略相对定量和绝对定量。相对定量指的是在样本中靶标量相对于另ー參照物的量。绝对定量指的是用已知量的标准曲线来推算靶标的未知量。在ー份核酸混合物样品中利用real-time Q-PCR技术定量分析各成分，除每次主要只能分析ー个成分外，无论是相对定量还是标准曲线定量方法仍存在ー些PCR定量方法均有的问题有待解決。在标准曲线定量中，标准品的制备是ー个必不可少的过程。目前由于无统ー标准，各个实验室所用的生成标准曲线的样品各不相同，致使实验结果缺乏可比性。此外，用real-time Q-PCR来研究mRNA时，受到不同RNA样本存在不同的逆转录(RT)效率的限制。在相对定量中，其前提是假设内源控制物(參照物)不受实验条件的影响，合理地选择合适的不受实验条件影响的内源控制物也是实验结果可靠与否的关键，实验证明要做到这一点是很难的。另外，与传统的PCR技术相比，Real-time Q-PCR的不足之处是(I)由于运用了封闭的检测，減少了扩增后电泳的检测步骤，因此也就不能监测扩增产物的大小；(2)因为荧光素种类以及检测光源的局限性，从而相对地限制了 real-time Q-PCR的复合式(multiplex)检测的应用能力；(3)目前real-time Q-PCR实验成本比较高,技术操作难度大，从而也限制了其广泛的应用。
本发明目的在于提供一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，解决了现有技术中荧光实时定量PCR方法进行核酸定性和定量检测中的种种不足之处。为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案是一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(I)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；(3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；(4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库；(5)采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测結果。优选的，所述方法中固相载体为微球。优选的,所述方法中固相载体为磁性微球。优选的，所述方法中所述亲和素选自卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素。优选的，所述方法中所述第一接头DNA片段具有SEQ No 1的连续核苷酸序列，且5’端通过生物素进行标记；第ニ接头DNA片段具有SEQ No 2的连续核苷酸序列。优选的，所述方法中所述第一引物由第一接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成；所述第二引物由第二接头DNA片段、ACTG碱基组和用于特异性扩增目的基因靶向序列，含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列的特异性引物连接而成。优选的，所述方法中所述第一引物进行第一次PCR扩增的第一 PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第一 PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度I IOX ; dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列终浓度为O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2终浓度为 O. 5 5mM。优选的，所述方法中所述第二引物进行第二次PCR扩增的第二 PCR反应体系包括PCR缓冲液、dNTPs、MgCl2, TaqDNA聚合酶、待捕获的目的基因区域序列作为模板DNA，所述第二 PCR反应体系终浓度组成为PCR缓冲液终浓度I IOX ; dNTPsO. 01 I. 5mM ；引物序列终浓度为O. 01 2 μ M ;模板DNAO. 01 IOng/ μ L ；TaqDNA 聚合酶 O. 01 I. OU/ μ L ;MgCl2终浓度为 O. 5 5mM。优选的，所述方法步骤(I)中待捕获的基因组是从选自人或动物或微生物群体中提取的。优选的，所述方法步骤(5)中高通量测序技术选自454焦磷酸测序方法、IlluminaSolexa合成测序方法、ABI SOLiD连接法测序方法、Life technologies公司的Ion torrent测序方法、单分子测序方法。优选的，所述方法步骤(5)中进行核酸的定性分析和定量分析是利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法来完成。本发明待捕获的基因组样本来自包括但不限于人或动物血液组织、其他组织和排泄物的基因组和转录组；人或动物的口腔、皮肤和肠胃微生物菌群基因组；土壌、水、树林、草地等生态环境中微生物群体的基因组等等。作为示例，如外周血细胞、外周血血清或血浆、体液、腔道的脱落物、病变新鲜组织、冰冻病变切片、石蜡病变切片。本发明基于高通量测序原理来完成的，本发明首次完成了核酸“测序-定性”、相对“测序-定量”和绝对“测序-定量”的方法，利用对ー份核酸样本中几十万到上百万个不同DNA分子同时测序鉴定后，利用计算机软件计数和简单的统计分析(t-test)、标准差分析方法就可完成对样本的准确定性定量。该方法克服了需要real-time Q-PCR标准曲线的方法，省去了逆转录效率的限制，本方法实验成本很低，并结合采用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法进行高通量测序后，就是ー个“直接点数”识别各种不同核酸分子后定性和定量同时完成。检测一次获得几百上千万个数据只需要数百元人民币。所述的多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法，包括以下步骤(I)将待捕获的基因组随机打断后采用第一引物进行第一次PCR扩增；所述第一引物一端与标记有生物素的第一接头DNA片段相连，并与待捕获的目的基因区域序列互补结合的寡核苷酸单链序列；(2)使用捕获组分对进行第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列进行捕获；所述捕获组分包括亲和素和与亲和素结合的固相载体；所述亲和素与所述第一次单向PCR扩增后的目的基因区域序列上的生物素相结合；(3)使用第二引物对亲和素结合后的目的基因区域序列进行第二次单向PCR扩增；所述第二引物一端与第二接头DNA片段相连，并与所述目的基因区域序列互补结合，且与第一引物进行PCR扩增的方向相反；(4)将第二次单向PCR扩增后的目的基因区域序列除去亲和素生物素复合物，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库。优选的多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法可以采用如下的步骤进行，如图I所示 (I)首先将基因组用超声破碎仪进行随机打断；(2)将单引物加入破碎的基因组中进行单向PCR扩增。单引物由DNA特异引物在5’端与接有生物素的接头DNA相连；(3)用链霉亲和素磁珠将携帯生物素(Bio)的单链目的片段DNA进行捕获；(4)用特异性引物对捕获的DNA进行第二次单向PCR扩增；(5)除去带有生物素的单链，获得两端带有相同或不同DNA接头的单链DNA文库(文库DNA相同序列分子也可以是不同系列的分子)；(6)文库DNA用于测序或其它任何应用。本发明多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法既集合了 in-solution的高特异性的优点，由具有操作简单、省时省力的优点，又具有用样品量少的优点。这样，进行核酸定性定量检测的方法可以按照如下步骤进行(I)提取样本的核酸(包括人或动物血液组织、其他组织和排泄物的基因组和转录组；人或动物的口腔、皮肤和肠胃微生物菌群基因组；土壌、水、树林、草地等生态环境中微生物群体的基因组等等)；(2)应用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法或其它成熟的技木，制备单链DNA(ssDNA)测序文库；(3)进行高通量测序；(4)对测序结果进行定性、绝对定量(计数)和进行相对定量(比较)。测序定性就是说对ー个未知的微生物群体或者对可能有癌细胞存在的人体中的基因组进行测序后，确定了微生物群体中的微生物的种类和肿瘤细胞确定存在以及存在的突变的位置。测序绝对定量就是对测序后测得的每ー种微生物种类或每ー肿瘤细胞种类的某一或某几个特定的基因进行计数得出ー个平均值作为群体中某一微生物或某一细胞的统计数目。测序的相对定量是对微生物种群中的不同微生物种类的统计数目的比值或者肿瘤细胞统计数目与正常细胞的统计数目的比值，这样可以辨别微生物种群中什么微生物是核心种群，以及肿瘤细胞达到什么样的比例是初期、中期或后期。如本文所用，术语“亲和素”包括卵白亲合素(Avidin，A)、链霉亲合素(Streptavidin, SA)、卵黄亲合素及类亲合素等。该术语还包括野生型、突变型以及衍生型的亲和素。如本文所用，术语“生物素”(biontin，B)广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244. 31Kd。生物素分子有两个环状结构，其中I环为咪唑酮环，是与亲和素结合的主要部位；11环为噻吩环，C2上有一戊酸侧链，其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的惟一结构，经化学修饰后，生物素可成为带有多种活性基团的衍生物——活化生物素。如本文所用，术语“固相载体” 一般选择可结合如亲和素或链霉亲和素等大分子蛋白质；生物大分子固相化后仍应保持活性，而且为有利于反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液。接头DNA片段分别设计如下，其可以通过PCR扩增的方式连接入DNA片段；也可以通过连接酶连接的方式连接入DNA片段。接头A :5’ -/BioTEG/GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3，；接头B :5，-CTCGAGAATTCTGGATCCTC-3，；捕获引物包括第一引物和第二引物，均由接头DNA片段+ACTG碱基组+与待扩增的基因组DNA片段配合的特异性引物(specific primer)组成。即第一引物的结构为接头A+ACTG+specific primer ;第二引物的结构为接头 B+ACTG+specific primer ;两引物中特异性引物根据所要捕获的不同基因而不同。所述的特异性引物(specific primer),为用于特异性扩增目的基因祀向序列,含有目的基因的至少15个连续的核苷酸序列；如进行PCR扩增血管性血友病基因的1-5个外显子的特异性引物具有SEQ No 5 14的连续核苷酸序列。

本发明公开了一种基于高通量测序技术进行核酸定性定量检测的方法，包括采用多基因多区域两步单向扩增捕获特异核酸靶标方法进行制备单链DNA文库后，采用高通量测序技术对获得的单链DNA文库进行测序，然后对测序结果进行核酸的定性分析和定量分析，获得核酸定性定量检测结果。该方法比普通的real-timeQ-PCR定量方法成本低很多，应用更加广泛提高了核酸定量的样本通量，可以对核酸的系列进行精确的定性和定量。