专利名称：一种干扰核酸分子及应用的制作方法RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是由双链 RNA (double-strand RNA, dsRNA) 引发其同源信使RNA (messenger RNA，mRNA)酶解的一种转录后基因沉默形式(Nature. 1998，391: 806-811)。长双链RNA进入细胞后，被Dicer酶结合并切割。Dicer酶的切割产物长度通常为20 25bp (base pair，碱基对)，且在每条链的3’末端有2个核苷酸悬垂的小干扰RNA (small interference RNA, siRNA)。siRNA的一条链掺入到RNA-诱导的沉默复合物中(RNA-induced silencing complex，RISC)，与互补RNA的序列配对。RISC首先介导siRNA双链解旋，与RISC耦合的单链的siRNA以序列特异的方式与靶mRNA结合，之后由RISC的催化组分切割靶mRNA。切割靶mRNA可以抑制其翻译，最终抑制该基因的表达。 现已被证实在多种病毒感染性疾病和肿瘤的治疗中具有极大的潜力，是理想的阻断基因表达的治疗手段。RNAi在医药领域有广阔的应用前景，如抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等。双链干扰核酸可设计成能被Dicer酶剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是短的、不需Dicer酶剪切直接作为RISC底物的形式。合成的双链RNA与目的基因序列互补，导入细胞或生物体后，被内源的遗传物质识别，激活RNAi途径。利用这种机制，RNAi使靶基因的表达水平急剧下降。RNAi技术开辟了一个全新的治疗领域，目前国际上已有十余种siRNA药物进入临床阶段。其中有应用siRNA治疗老年性黄斑变性、糖尿病黄斑水肿、呼吸道合胞病毒病、实体肿瘤、肝癌、以及急性肾损伤等疾病。RNAi效应的dsRNA可设计成能被Dicer剪切的称做Dicer底物的长双链形式，或者是不需Dicer剪切可直接作为RISC底物的短siRNA形式。在哺乳动物细胞中，由于长 dsRNA容易引发非特异性的干扰素效应。因此，普遍认为应用于哺乳动物时，干扰RNA双链必须短于30 bp。但是，设计长双链干扰RNA用于RNAi仍有实用价值，长干扰RNA双链可带有多个治疗靶标，靶向多个不同靶基因的mRNA或同一靶基因的mRNA的不同位点，增加基因沉默效果，扩大应用范围。疾病的发生、发展往往是多种基因共同参与的复杂生物学过程， 受到多种因素的影响，在疾病的治疗中，单一基因的抑制不可能完全抑制或逆转疾病的发生和发展，单靶标治疗有其局限性。那么，研发多靶标、无干扰素反应的长干扰核酸双链，同时抑制多个疾病基因的表达，多层次、多途径治疗疾病，能有效提高治疗效果，可以作为治疗疾病的新途径。
本发明旨在提供一种核酸分子及其应用，尤其是干扰核酸分子及其应用。该干扰核酸分子的反义链靶向不同靶基因的RNA或同一个靶基因RNA的不同位点，该RNA可以是mRNA、微小RNA (microRNA，miRNA)或是mRNA或miRNA的子序列，并且该干扰核酸分子不引起体内的干扰素反应。本发明公开了一种干扰核酸分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链中的至少两个部分分别靶向不同基因的 RNA或同一基因RNA的不同位点，该核酸分子进入细胞后不会引起干扰素效应。本发明还公开了一种干扰核酸分子，由正义链和反义链退火形成，每条链的长度至少为30个核苷酸，其反义链中的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA 的不同位点，其中，所述的正义链中存在至少一个长度至少为7个核苷酸的自身互补的环状核苷酸结构，该核酸分子进入细胞后不会引起干扰素效应。优选地，所述的干扰核酸分子，由一条正义链和两条反义链组成，且每条正义链和反义链皆含有5’端和3’端，其中正义链的5’端与第一条反义链的3’端互补；正义链的 3’端与第二条反义链的5’端互补；第一条反义链的5’端和第二条反义链的3’端互补，经退火后，形成具有二级结构的核苷酸双链。应用这种具有二级结构的、由正义链或反义链构成的长干扰核酸没有激发哺乳动物细胞的干扰素反应。优选地，所述的双链中含有至少一个糖环修饰或骨架修饰的核糖核苷酸。本发明还提供了所述的干扰核酸分子在制备调节细胞中至少一种基因功能的药物中的应用。所述的基因为疾病相关基因。所述的疾病相关基因包括病原体相关基因如病毒基因，以及非传染性疾病相关基因如肿瘤相关基因。所述的肿瘤为肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤、鼻咽癌和口腔癌中的至少一种。本发明有望在抑制、缓解或减轻病情或防止某些疾病症状的复发方面取得更显著的治疗效果。本发明与现有技术相比，该核酸分子能够同时抑制多个靶基因的表达，或者靶向一个靶基因的多个位点。此外，并未引起干扰素效应，可应用于哺乳动物细胞。本发明公开的核酸分子是一种新的siRNA的应用形式，在对疾病的基因治疗方面有广泛的应用前景。图1是核酸分子By-Pass结构示意图。该核酸分子正义链上存在一个自身互补的发卡环状核苷酸结构，且正义链的5’端与反义链1的3’端互补；正义链的3’端与反义链 2的5’端互补；反义链1的5’端和反义链2的3’端互补，经退火后，形成具有二级结构的核苷酸双链。图中，1为正义链，2为反义链1，3为反义链2，4为自身互补的发卡环状核苷酸结构。图2是SMMC-7721肝癌细胞中Survivin基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中， 纵坐标表示Survivin基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图3是SMMC-7721肝癌细胞中Bcl_2基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示Bcl-2基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图4是SMMC-7721肝癌细胞中干扰素相关基因OASl基因的mRNA相对表达水平柱形图。图中，纵坐标表示OASl基因的mRNA相对表达水平，横坐标表示不同实验组。图5是SMMC-7721肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值，即OD 值，横坐标表示不同核酸分子作用细胞的不同时间。4
图6是不同核酸分子对肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。图7是!fepG2肝癌细胞的生长曲线图。图中，纵坐标表示紫外吸光值，即OD值，横坐标表示不同核酸分子作用细胞的不同时间。图8是不同核酸分子对肝癌细胞H印G2的生长抑制率柱形图。图中，纵坐标表示细胞生长抑制率，横坐标表示不同实验组。

设计靶向Survivin和Bcl_2基因的核酸分子By-Pass
细胞凋亡抑制基因Survivin和Bcl_2，在恶性肿瘤细胞中广泛高表达。研究发现，通过抑制肿瘤细胞中过表达的Survivin或Bcl-2基因，可以抑制肿瘤细胞的生长。用靶向性的siRNA抑制Survivin或Bcl_2基因的表达可能成为治疗肿瘤的新策略。设计核酸分子By-Pass，其包含一条正义链和反义链1、反义链2两条反义链，反义链1的3’端和5’端靶向到Survivin基因的mRNA ；反义链2的5’端靶向到Bcl_2基因的 mRNA，3’端靶向到Survivin基因的mRNA。核酸分子By-Pass的结构如图1所示。序列SEQ ID NO: 1是核酸分子By-Pass的正义链序列。正义链5，-GACUUGGCCCA⑶⑶UUCUCAUGCGUCGGGAUGACUGAGUACCUGAA-3， (SEQ ID NO: 1)
序列SEQ ID NO: 2是3’端与序列SEQ ID NO: 1的5’端互补的反义链1，序列SEQ ID N0: 3是5，端与SEQ ID NO: 1的3，端互补的反义链2，并且序列SEQ ID N0: 2的5，端和SEQ ID NO: 3的3，端互补。反义链1 :5，-UCCUUUCU⑶CAAGAAGCAGUUCAGAAACACUGGGCCAA⑶C-3， (SEQ ID NO: 2)
反义链 2 :5’ -UUCAGGUACUCAGUCAUCCCAACUGCUUCUUGACAGAAAGGA-3’ (SEQ ID NO: 3)
用于对比实验的siRNA :l)Sur-2是靶向Survivin基因的siRNA，其正义链序列是序列 (SEQ ID NO: 1)中5，端开始的1 19个核苷酸，反义链是序列(SEQ ID NO: 2)中3，端开始的1 19个核苷酸。2)Bcl-l是靶向Bcl-2基因的siRNA，其正义链序列是序列(SEQ ID NO: 1)中3，端开始的1 19个核苷酸，反义链是序列(SEQ ID NO: 2)中5，端开始的 1 19个核苷酸。实施例2
实时定量PCR检测核酸分子By-Pass对Survivin靶基因的沉默效果细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IXlO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。实时定量PCR检测Survivin基因mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA Kit (QIAGEN公司)提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用 80 μ L无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测Survivin基因的实时定量PCR引物
5’ 正向引物ACCGCATCTCTACATTCAAG (SEQ ID Ν0: 4) 3，反向引物CAAGTCTGGCTCGTTCTC(SEQ ID N0: 5)
用上述Survivin基因特异性引物检测样本中Survivin基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下反应体系4 μ L模板RNA， 12. 5 μ L 2XSensiMix One-St 印(Quantance 公司)，1 yL 5，正向引物(10 μΜ)，1 μ L 3，反向引物(10 μΜ),0. 5 yL 50XSYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ L。反应条件42°C反转录 30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸30 sec，循环45次。用2_δ Δα分析法分析实验结果，并作柱状图，如图2所示，核酸分子By-Pass显示对肝癌细胞中Survivin基因较好的沉默效果，与相应的Sur_2、Sur-10实验组及共转染实验组Sur-2+Sur-lO+Bcl-l相比，其抑制效率无明显差异。实施例3
实时定量PCR检测核酸分子By-Pass对Bcl_2靶基因的沉默效果细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。
实时定量PCR检测Bcl-2基因mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA KitCQIAGEN公司)提取纯化细胞mRNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μ L无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测Bcl-2基因的实时定量PCR引物
5’ 正向引物GGCTGGGATGCCTTTGTG(SEQ ID NO: 6)
3，反向引物GCCAGGAGAAATCAAACAGAGG (SEQ ID NO: 7)
用上述Bcl-2基因特异性引物检测样本中Bcl-2基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系4 μ L模板 RNA, 12. 5 μ L 2XSensiMix One-Step, 1 μ L 5，正向引物(10 μΜ)，1 μ L 3，反向引物 (10 μΜ),0. 5 μ L 50 X SYBR Green I，用无 RNase 水补足体系至 25 μ L。反应条件42°C 反转录 30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火 30 sec，72°C延伸 30 sec，循环45次。用2_δ Δε 分析法分析实验结果，并作柱状图，如图3所示，核酸分子By-Pass显示对肝癌细胞中Bcl-2基因较好的沉默效果，与相应的Bcl-I实验组和共转染实验组 Sur-2+Sur-lO+Bcl-l相比，其抑制效率无明显差异。实施例4 检测干扰素反应
细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IXlO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10 % FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。实时定量PCR检测干扰素相关基因OASl的mRNA表达用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA Kit (QIAGEN公司)提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用 80 μ L无RNase水/孔溶解RNA，取4 μ L RNA为模板进行实时定量PCR反应。检测干扰素相关基因OASl的实时定量PCR引物
5，正向引物GTGAGCTCCTGGATTCTGCT(SEQ ID NO: 8)
3，反向引物TGTTCCAATGTAACCATATTTCTGA (SEQ ID NO: 9) 用上述干扰素相关基因OASl特异性引物检测样本中OASl基因mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系4 μ L 11 RNA, 12. 5 μ L 2 X SensiMix Onelt印，1 yL 5，正向引物(10 μΜ)，1 yL3，反向引物(10 μΜ)，0. 5 μ L 50 X SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ L0反应条件42°C反转录30 min，95°C预变性 7 min，95°C变性 20 sec，60°C退火30 sec，72°C延伸 30 sec，循环45次。用2_ΔΔ"分析法分析实验结果，并作柱状图，如图4所示。实验中，用上述转染方法按5 ng/孔同时转染Poly (I:C)作为阳性对照。聚肌胞(Poly (I:C))是一种类似于感染性病毒的核糖核酸的合成化学物质，可以刺激细胞的免疫系统产生干扰素。与正常组相比，阳性对照组OASl基因的mRNA有明显的升高，其它不同RNA分子转染实验组OASl基因没有高表达，该结果表明核酸分子By-Pass未引起干扰素反应。
实施例5
CCK-8法检测核酸分子By-Pass对肝癌细胞SMMC-7721的抑制率细胞培养肝癌细胞SMMC-7721在含10% FBS的DMEM培养基(Gibco公司)中，37°C、 5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按Lipofectamin 2000 (Invitrogen公司)的操作步骤进行，实验的不同RNA分子按浓度为10 nM/孔加入。CCK-8测定每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液(同仁化学)。在细胞培养箱内继续孵育0.5 4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。根据所测得的~5(|值(( 值)，作生长曲线图，如图5所示。根据公式细胞增殖抑制率=(1 一实验组平均A45tl值/对照组平均A45tl值)父100%，计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图6所示。结果表明核酸分子By-Pass在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。实施例6
CCK-8法检测核酸分子By-Pass对肝癌细胞!fepG2的抑制率
细胞培养肝癌细胞H印G2在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养。细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照Lipofectamin 2000 (Invitrogen 公司)的说明书转染，RNA 按 IOnM/ 孔加入。CCK-8测定每孔加入1/10培养基体积的CCK-8溶液(同仁化学)。在细胞培养箱内继续孵育0.5 4 h。用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。结果分析根据所测得的A45tl值(( 值)，作生长曲线图，如图7所示。根据公式 细胞增殖抑制率=(1 一实验组平均A45tl值/对照组平均A45tl值)X 100%，计算细胞生长抑制率，并作柱状图，如图8所示。结果表明核酸分子By-Pass在作用肝癌细胞48 h、72 h、96 h后有显著的抑制效果，与其它实验组相比无明显差异。


本发明涉及一种核酸分子及其应用，尤其是指干扰核酸分子及其应用。所述的干扰核酸分子，其特征在于，由正义链和反义链退火形成，每条链的长度至少为30个核苷酸，其正义链或反义链中的至少两个部分分别靶向不同基因的RNA或同一基因RNA的不同位点，该核酸分子进入细胞后不会引起干扰素效应。该核酸分子能干扰转录后翻译过程，从而抑制或阻断基因表达，且该干扰核酸分子不引起干扰素反应。所述的核酸分子是制备调节细胞中一种或多种基因功能的药物中的活性成分。