转移核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途制作方法_G·希本科顿,R·克里斯汀专利（核酸,转运,细胞）-早鸽网

转移核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途制作方法

专利名称

转移核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途制作方法
发明者

G·希本科顿, R·克里斯汀
公开日

2002年3月6日
申请日期

2000年1月3日
优先权日

1999年1月8日
申请人

阿马克萨有限公司
文档编号

A61P35/00GK1339068SQ00803447
关键字

核酸转运细胞转移系统通过
权利要求

1.一种核转运剂，由两个模件A和B组成，其中模件A与DNA特异性结合，并且不导致形成含一个以上DNA分子的复合物，并且其中模件B含有不介导该核转运剂与该DNA非特异性结合的核定位信号2.如权利要求1的核转运剂，其中模件A序列特异性地与DNA结合3.如权利要求1的核转运剂，其中模件A特异性地与DNA端结合4.如权利要求1-3任一项的核转运剂，其中模件A为肽、蛋白质或PNA(肽核酸)5.如权利要求1-4任一项的核转运剂，其中模件B含有一因其电荷不与DNA形成复合物的延长核定位信号6.如权利要求5的核转运剂，其中模件B含有一具有几乎中性净电荷的延长核定位信号7.如权利要求6的核转运剂，其中模件B含有一延长核定位信号，它含有核定位信号和侧翼带负电荷的氨基酸8.如权利要求5-7任一项的核转运剂，其中模件B除了含有核定位信号或延长核定位信号之外，还含有不直接属于核定位信号的肽序列或非肽组分9.如权利要求1的核转运剂，其中模件A为PNA，模件B含有代替NLS信号或除NLS信号之外的非NLS信号10.如权利要求1的核转运剂，其中模件A为一以序列特异性方式与DNA结合的蛋白质，模件B含有代替NLS信号或除NLS信号之外的非NLS信号11.如权利要求9的核转运剂，其中非NLS信号选自能够介导DNA摄取的细胞表面结构的配体、使膜去稳定化的肽和在细胞中介导与转运结构结合的信号，以及引起保留在核中的信号12.一种基因转移系统，含有权利要求1-11任一项的核转运剂和一阳离子脂质、肽、多胺或阳离子聚合物13.一种将DNA转运到真核细胞的核中的方法，其中所述细胞用待转运的DNA和权利要求1-1 1任一项的核转运剂转染14.如权利要求13的方法，其中所述真核细胞为初级细胞15.一种含有权利要求1-11任一项的核转运剂的药用组合物16.权利要求1-11任一项的核转运剂在基因疗法中的用途17.权利要求1-11任一项的核转运剂在治疗癌症、病毒感染、神经系统疾病、移植排斥和单基因或多基因遗传疾病的基因疗法中的用途
技术领域

本发明涉及一种核转运剂、一种含有所述核转运剂的基因转移系统、一种使用所述核转运剂将DNA转运到真核细胞核中的方法以及所述核转运剂在治疗癌症、病毒感染、神经系统疾病、移植排斥和单基因或多基因遗传疾病的基因疗法中的用途向核中的主动转运是将遗传材料转移到在打算表达遗传材料之前的时间内不分裂的所有细胞中必不可少的由于核酸的核转运系统有利于有效地将DNA转移到很少分裂或根本不分裂的这些细胞中，因此核酸的核转运系统非常重要(Dowty等人，1995，Wilke等人，1996)大多数初级细胞属于这一类初级细胞在科学上最感兴趣有两个原因首先，刚从生物体中分离的所述细胞反映的细胞类型的功能状态比由此获得的细胞系的好得多其次，它们是基因疗法的靶细胞此外，核转运系统通过使这些细胞也能表达转移的遗传材料增加了DNA向建立的细胞系转移的效率，它们在转移开始和分析之间的时间内尚未分裂遗传材料在细胞核中有活性其中的转运或者可以在核被膜在有丝分裂过程中临时分裂时在细胞分裂期间同时进行或者它必须主动地进行1)通过核定位信号将核蛋白转运到该细胞核中包封该核的双层膜具有孔小分子可以经扩散通过这些孔为了能够进入核，大于约50kDa的蛋白质需要一核定位信号(NLS)，该信号必须通过转运机器识别典型地，足够的信号由4-8个氨基酸组成，富含正氨基酸精氨酸和赖氨酸并含有脯氨酸它在进化中强烈地保守，这样哺乳动物NLS也在酵母中起作用异源NLS还可以用作将靶分子转运到核中的工具为此，NLS可以相对随机的位置加入到胞质蛋白质的序列中，或者可以化学偶联到蛋白质或者甚至金颗粒上(参见G?rlich，1998)2)许多病毒使用其细胞的核蛋白转运机将其DNA转运到其核中能够感染静息细胞的HIV和其它慢病毒使用病毒蛋白和细胞转运机器将其DNA转运到其核中Vpr中的NLS和HIV预整合复合物中的基质蛋白(Gallay等人，1996)是感染不分裂的细胞所必需的(Naldini等人，1996)尽管几乎不知道病毒是如何将其基因组转移到其核中的，但是含有NLS的病毒结构蛋白的帮助甚至可能是一般原理通过以下观察也暗示了这一点在HSV衣壳蛋白中的特异性突变防止了病毒DNA向其核中的转运(Batterson等人，1983)腺病毒DNA与分裂衣壳的六邻体蛋白一起转运到核中(Greber等人，1993)SV40 DNA向核中的转运由保持与DNA结合的病毒蛋白(可能是Vp3)介导(Nakanishi等人，1996)含有NLS的两种细菌蛋白负责根癌土壤杆菌T-DNA向植物细胞核的输入(Citovsky等人，1994)由于一些病毒能够感染静息细胞，因此将例如HIV、腺病毒和疱疹病毒的突变体变体用作开发基因疗法方案的DNA转移载体首先，这涉及与病毒组分的免疫反应的危险(Friedmann 1994，1996)，其次，将辅助细胞系用于这些系统，为此不能排除突变较少的病毒基因组的释放而且，这些系统难以操纵已描述了通过含有核定位信号的肽或蛋白质推断提高转染效率的几个人工系统A)蛋白质Kaneda等人(1989)以及Dzau和Kaneda(1997，US5,631,237)描述了一种基因转移系统，它是以使用仙台病毒、脂质体和意思是支持DNA的核转运的加入的蛋白为基础为此，该组使用HMG-1(″高迁移率组1蛋白″)，一种与DNA结合的碱性非组蛋白的染色质蛋白质HMG-1通过一长碱性区与DNA结合它位于核内，但没有已知的NLS在体外，HMG-1蛋白质与载体DNA形成复合物纯化HMG-1的生产费用高且为劳动密集型Mistry等人(1997)描述了与HMG-1-介导的核转运有关的实验由于作为复合DNA的转染试剂的其正电荷HMG-1在这里用于使DNA通过细胞膜Wako BioProducts公司(Richmond，VA，USA)作为介导核转运的脂转染试剂的添加剂销售(1997)蛋白质HMG-1和-2Fritz等人(1996)用小牛胸腺组蛋白或由SV40 NLS和人组蛋白H1组成的重组蛋白进行了一相似试验这两种蛋白都明显地与DNA形成大的复合物，正如出版物中所示，它们适宜通过细胞膜，但不适宜核转运B)由于含有NLS序列的合成肽生产简单且费用较低，因此也使用它们P.Alestr?m的小组(Collas等人，1996，Collas和Alestr?m，1996，1997a，b)使用来自SV40的NLS肽复合DNA，并通过该细胞将其转运到核中该DNA的结合仅通过对其功能必不可少的NLS的正电荷氨基酸发生只要DNA与肽复合，这将导致遮蔽核转运蛋白的实际信号在由海胆精子在体外形成的分离雄性原核中，当它们在斑马鱼受精卵的溶胞产物中培养时，能观察到荧光标记的DNA的NLS依赖性转运在摩尔比≥100∶1(NLS肽∶载体)和载体拷贝/细胞≥1000时，在斑马鱼胚胎中，当将载体DNA微量注射到细胞的细胞质中时，观察到荧光素酶表达增加(在100个肽/载体和1000个注射载体下与0个肽比较获得了六倍增加)由于其密度高，可能并非所有NLS都与该DNA完全结合，并且因此部分仍是转运机器可及的；这可能是为什么完全可以观察到作用的原因(参见Sebastyén等人，1998)转运机器可能能够识别由两个肽序列组成的信号(Boulikas，1993)Sebastyén等人(1998)共价地偶联了成千上百的DNA分子的SV40 NLS肽，并在该DNA链的全长上对NLS进行了扫描由于其大量修饰，该DNA不再能被转录正如该文章中所讨论的，由于空间原因，当如此之多的NLS肽结合，致使它们中间不是所有都通过与DNA的负电荷相互作用遮蔽时，DNA明显地仅被转运到核中Gopal(US5670347)描述了一种由DNA结合碱性区、弹性铰链区和NLS组成的肽由于在这种情况下DNA结合也是由氨基酸正电荷完成的，因此试剂与DNA形成意味着同时用于穿过细胞膜转运的复合物NLS序列为什么不应参与DNA结合，以致只要肽偶联其上，核转运蛋白的实际信号就可能再被DNA遮蔽的原因并不清楚而且，产生的复合物可以变得非常大(Emi等人，1997，Niidome等人，1997，Wadhwa等人，1997，Trubetskoy等人，1998)，这将会减少通过核孔转运(Lanford等人，1986，Yoneda等人，1987，1992)还未证明起超出多阳离子肽作为转染试剂的已知功能的作用，它支持DNA通过细胞膜(Sorgi等人，1997，参见Hawley-Nelson等人，1997)Gerhard等人(DE-OS 19541679)提出了用于基因转移的NLS多赖氨酸缀合物在这种情况下，由阳离子多赖氨酸、阳离子NLS和DNA组成的呈现复合物也确实遮蔽该核转运信号，只要其与该DNA偶联Szoka(PCT1993，权利要求23-27)通过一嵌入剂将NLS肽与DNA偶联在预培养载体和肽(比例为1∶300)之后，脂转染的效率增加4-5倍由于其高的正电荷，所用的SV40肽能够复合DNADNA与阳离子肽的复合导致通过提高穿过细胞膜的效率的脂转染效率增加(Sorgi等人，1997，参见Hawley-Nelson等人，1997)由此使核转运稍有减少，至少当生成大的复合物时(参见上面)由于所用的NLS肽因其电荷与DNA结合，因此削弱了核转运机器对转运信号的识别(参见上面)使用该实施例中所述的诱变嵌入剂限制其应用Szoka提出，非共价且非特异性，但是，如上所述，结合的转染用的其它分子也与DNA不能防止NLS肽本身与该DNA结合和复合没有讨论NLS肽与DNA直接结合的问题Hawley-Nelson等人(US5736392)描述了一种类似系统将一NLS肽与载体DNA或者直接混合或者在与DNA-结合分子共价偶联之后混合然后将生成的复合物用于脂转染(或其它转染)在该系统中，加入没有NLS的多阳离子肽增加转染效率，甚至比加入阳离子NLS多亚精胺与NLS肽偶联不会使转染效率进一步增加因此，同样在这种情况下，经阳离子肽的DNA的复合仅解释了扩增作用由于NLS的存在没有进一步增加转染效率，因此可以假定核转运机器的识别序列在这种情况下也被遮蔽了TIB Molbiol公司(传单1998)描述了PNA寡核苷酸和C-端NLS肽一起转运以特异性地抑制选择基因的表达该NLS用于将这些PNA寡核苷酸转运到核中，以便它们然后可以与其靶序列杂交迄今，将DNA转运到核中的已知试剂的缺陷是效率非常低该低效率不足以使静息细胞成为可转染的因此，本发明的问题在于提供一种核转运剂，它能将DNA有效转运到核中，从而静息或仅非常缓慢分裂的细胞也变为可在有用程度上转染的该问题通过一由两个模件A和B组成的核转运剂得到解决，其中模件A特异性地与DNA结合，不会导致通过非特异性结合形成含一个以上DNA分子的复合物，并且模件B含有不与DNA非特异性结合的核定位信号或非NLS信号本发明的优选核转运剂含有与DNA序列特异性地结合和/或与DNA端特异性结合的模件A特别优选的是其中模件A为一合成肽、蛋白质或肽核酸(PNA)的核转运剂在本发明核转运剂的另一实施方案中，模件B含有一因其电荷不与DNA形成复合物的延长核定位信号优选核转运剂中模件B含有一具有几乎中性净电荷的延长核定位信号特别优选核转运剂中模件B含有一含核定位信号和侧翼带负电荷的氨基酸的延长核定位信号NLS序列不必与天然存在的NLS序列相同，但是也可以为基于理论考虑的氨基酸序列，只要它起NLS的作用而且，模件B可以含有肽序列或不直接属于核定位信号或延长核定位信号的非肽组分优选为增加核定位信号与模件A之间距离的组分而且，本发明涉及一种含本发明核转运剂和阳离子脂质、肽、多胺或阳离子聚合物的基因转移系统而且，本发明涉及一种将DNA转运到真核细胞，优选初级细胞的核中的方法，其中使用待转运的DNA和本发明核转运剂通过本领域已知的方法转染这些细胞另一实施方案涉及本发明的核定位剂在基因疗法，特别是治疗癌症、病毒感染、神经系统疾病、移植排斥和单基因或多基因遗传疾病中的用途本发明所用的词语“核定位信号与DNA的非特异性结合”是指防止核定位信号对于核转运机器是完全可识别的结合本发明所用的词语“模件A与DNA的特异性结合”，首先是指序列特异性的结合，其中DNA核苷酸的序列对这种相互作用起着决定性作用，其次是指与由DNA单或双链端介导的DNA的共价结合本发明所用的词语“延长核定位信号”是指核定位信号具有附加的侧翼氨基酸优选延长核定位信号具有2-40，优选4-20个附加的侧翼氨基酸本发明所用的词语“因其电荷不与DNA形成复合物的延长核定位信号”是指模件B含有其电荷以如下方式分布的核定位信号它与DNA非特异性地相互作用，因此对于核转运机器来说仍是完全可及的本发明所用的词语“几乎中性净电荷”是指核定位信号的延长部分具有与实际核定位信号的正电荷平衡的带负电荷的氨基酸，这样在延长核定位信号的整个区域中存在不超过3个剩余正电荷本发明的核转运剂具有不引起DNA复合的优点另一优点是该核定位信号可以自由靠近核转运机器避免形成削弱核转运的大的DNA复合物以及当使用本发明的核定位剂时核定位信号对核转运机器的可接近性，使得DNA向核中的转运明显更有效根据本发明，DNA-结合部分(模件A)或核定位信号(模件B)都不会导致形成大的DNA复合物模件A模件A特异性地结合DNA，并且不引起具有一个以上DNA分子的复合物的形成模件A序列特异性地(即仅因正电荷不是非特异性地)或者共价地与DNA端结合模件A可以是不同长度的肽或者蛋白质或者PNA序列(Nielson等人，1991)或者以序列特异性的方式与核酸结合的另一种物质而且，模件A可以是特异性地与DNA结合的重组蛋白，作为例如lac阻抑物或其高亲和力突变体(Kolkhof，1992，Fieck等人，1992)、或者序列特异性地与DNA端(具有LTR核心序列)结合的逆转录病毒整合酶(Ellison和Brown，1994)如果线性DNA链端具有为“自杀底物”的序列并可经拓扑异构酶裂解但不驱逐的话，那么与DNA链端的共价结合可以例如经痘病毒的拓扑异构酶1生物介导(Shuman，1994)模件B模件B为不与DNA非特异性结合的核定位信号或非NLS信号本发明的术语“非NLS信号”是指不是核定位信号，但就转染、基因疗法或DNA接种而言用于将DNA转运到细胞中或在细胞内转运DNA的信号以下属于非NLS信号细胞表面结构的配体，它能够介导DNA摄取，例如受体介导的DNA摄取；例如为了促使内体中的DNA过早出来而使膜去稳定化的肽；在细胞中介导与转运结构结合以利于向核中的胞内转运的信号核定位信号优选为因其电荷或对DNA结合模件A的空间定向不与DNA形成复合物的延长核定位信号(如上所定义的)核定位信号可以经合成产生或者可以为蛋白质的一部分在本发明的核转运剂中使用的核定位信号中，不通过其正电荷与DNA结合的信号序列-有和没有侧翼区-以如下方式使用作为大多数核定位信号的主要部分的这些电荷作为核转运机器的信号被遮蔽除了核定位信号或非NLS信号之外，模件B可以含有肽序列和非肽组分，它们不是核定位信号或延长核定位信号的一部分优选它们能较好地立体定位该核定位信号，尤其是增加与DNA分子之间的距离经典的NLS的延长序列是完全适宜的，条件是肽的净电荷几乎能够被侧翼带负电荷的氨基酸平衡这些氨基酸可以天然地存在于蛋白质的这些位置或者可能已在结构考虑的基础上引入最初，将负电荷氨基酸定位与许多NLS核心序列相邻(Xiao等人，1997)可以证明SV40的NLS作为最彻底调查过的NLS，这些侧翼序列可明显提高核转运效率(Rihs和Peters，1989，Rihs等人，1991，Chen等人，1991，Jans等人，1991，Xiao等人，1997)仅在将其化学地偶联到已由相邻序列延长的SV40 NLS之后，但是不在将其与SV40核心NLS肽偶联之后，将大蛋白质(IgM)转运到核中(Yoneda等人，1992)如果NLS为序列特异性地与DNA结合的蛋白质的一部分时，这些序列被DNA遮蔽的危险性相对较低但是由于其高效率，在这种情况下也可以使用延长的NLS序列也可以使用非经典的NLS，例如作为来自流感病毒核蛋白的NLS(Wang等人，1997，Neumann等人，1997)，它们没有大量过量的正电荷或者不经过常规转运途径到达核中T.Boulikas(1993，1996，1997)(不完全)概述了打算用于本文的NLS最后，可以使用得自核转运机器本身组分的核转运信号，作为例如输入素(importin)α的输入素β结合结构域(IBB)经过该结构域，NLS结合蛋白输入素α与核转运机器的剩余部分相连(G?rlich等人，1996，Weiss等人，1996)在另一优选实施方案中，使非NLS信号经PNA(作为模件A)与现有载体序列结合PNA和载体之间的结合为序列特异性的这使得这些非NLS信号可以与几乎所有常规表达载体偶联，而不需要对它们进行修饰就PNA与DNA的序列特异性结合而言，仅使用载体的那些DNA序列，经PNA的这种遮蔽基本上不削弱DNA的预期目的在表达载体的情况下，特别是使用质粒主链中的序列，尤其是存在于大多数常规表达载体中的序列(例如氨苄青霉素抗性基因的启动子)然而，在表达区的非编码链中结合也是可能的序列特异性结合的优点是PNA-肽-杂种与DNA简单而快速的结合实施例2证实了例如PNA-肽-杂种与双链DNA的简单而快速的结合反应(5分钟，65℃)在PNA部分和实际信号之间可能有一间隔该间隔可以增加信号与DNA之间的距离，从而例如减少位阻该间隔还可用于引入预定断裂点，从而例如使内体环境中的配体分离，由此使DNA结合到胞吞的细胞表面受体上本发明首次使静息细胞或缓慢分裂细胞可转染至允许以后分析的百分数刚从动物体或人体分离的大多数细胞(初级细胞)根本不分裂，或者难得分裂，以致在DNA成功地通过细胞膜转运之后，在其到达核并能够被表达之前它被失活至此这使得初级细胞不能转染，除非它们经人工刺激培养增殖这种不可避免的后果是这些细胞然后偏离其原始状态一种转染初级细胞的方法允许在体细胞的最初条件下分析遗传材料这对于遗传机理的调查和在体细胞内加工的研究是至关重要的使初级细胞可转染的本发明的教导对基因疗法的完全人造的基因转移系统也是一个重要的步骤这种基因转移系统必需具有3个功能性组分一种使DNA通过细胞膜的组分，为此已证实阳离子脂类和其它阳离子聚合物相对适合它必须含有将DNA转移到靶细胞(通常是非分裂性的)的核中的另一组分，以及介导DNA整合到基因组中的第三组分在本发明中，首次描述了可以用作第二组分的有效试剂可用于基因疗法的完全人造的基因转移载体可望比目前使用的病毒系统更容易地生产，成本更低，更易操作，并且它不易遭受这些系统的内在危险例如已提出基因治疗方案用于治疗癌症、AIDS和各种遗传疾病，并将在医学中发挥重要作用在这些至今已可转染的培养细胞中通过使那些在DNA通过细胞膜与分析之间的时间内不分裂的细胞可以用于摄取DNA，本发明所述的核转运剂也可增加转染效率由于甚至对许多建立的细胞系而言转染效率的增加将会有利于分析并且因所需细胞材料的量降低而有助于降低成本，由此这是很重要的当然，这对于初级细胞和建立的细胞系之间的所有阶段也是如此以下实施例用于说明本发明，但并不打算限制本发明的范围实施例1PNA-肽-杂种使用NLS PNA核转运剂使用能够侵入DNA双链的PNA序列(Nielson等人，1991，Nielson，US5,539,082)在几乎所有表达载体的质粒主链中，完全适合与PNA高亲和相连的两个序列位于氨苄青霉素抗性基因和复制起点中作为肽组分，所用的肽含有或者1)″SV21″NH2-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽1；SEQ ID NO1)，或者2)″SV27″NH2-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH(肽2；SEQ IDNO2)以下PNA序列位于每个肽的N-端或者A)″ori″NH2-CCTTTCTCCCTTC-肽(SEQ ID NO3)，或者B)″ssp″NH2-CTCTTCCTTTTTC-肽(SEQ ID NO4)，或者C)肽-PNA杂种序列NH2-CCTTT-GGGGGGG-TTTCC-肽(SEQ ID NO5)，在平均表达载体(5kb)中它具有约30个结合位点(G＝氨基酸甘氨酸)将5μg溶于水中的载体DNA在10μl 25μM NLS-PNA中在60℃下培养10分钟然后用RPMI将该反应混合物调整至250μl将60-80％铺满的5×106个中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用5mM EDTA脱附，在15ml PBS中洗涤(在50×g下离心10分钟)将该颗粒再次悬浮在250μlRPMI中并与预培养的DNA混合，转移到电穿孔杯(间隙宽0.4cm)并在室温下培养10分钟电穿孔(210V，975μF，BioRad GenePulser)之后，将该电穿孔杯在37℃下培养另外10分钟，之后将这些细胞接种于预热培养基中为了明确地显示在实验开始和分析之间还未分裂的这些细胞被转染，按照所述方法用pMACS 4.1(人CD4的表达载体)转染细胞，并且对细胞分裂的评价如下转染之前，通过在1μM羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDA，SE)(Molecular Probes，Eugene，USA)中培养将细胞标记上绿色荧光通过细胞分裂使细胞亮度降低至50％使用流式细胞器(FACSCalibur)在单细胞水平上测得，未分裂的细胞(100％绿色荧光)也表达转染的基因(用与Cy5偶联的抗-CD4抗体染色之后为暗红色荧光)实施例2PNA-NLS与现有载体序列的快速结合将PNA-肽-杂种与双链DNA偶联现有载体序列可以经PNA用NLS-肽几乎定量地(90％)标记5分钟为了实现经PNA的热不稳定性组分的结合，在37℃下培养1小时就足够标记大多数DNA(表1)将100ng表达载体在TE(pH7.8)中用25μM的不同PNA-肽-杂种在65℃或者37℃下培养5分钟-3小时这里所用的PNA序列NH2-CTCTTCCTTTTTC-COOH(SEQ ID NO6)与氨苄青霉素抗性基因的启动子结合在其C-端定位一21个氨基酸的肽(肽1)或一27个氨基酸的肽(肽2)或者一10AEEA-单位的间隔(Fmoc-AEEA-OH间隔，PerSeptive生物系统公司，Framingham，USA)，之后是一27个氨基酸的肽(肽3)接着用限制性核酸内切酶Earl进行结合测定限制酶切DNA用YOYO(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR，USA)染色，在琼脂糖凝胶上分离并用荧光扫描器(ImagePlate Reader FLA 2000，分析软件L-Process，1.6版，东京富氏胶卷有限公司)定量DNA经限制性核酸内切酶Earl的裂解在PNA结合位点受到抑制其它Earl限制位点用作该反应的内部控制℃分钟肽1 肽2肽35 94％96％ 91％65 10 96％97％ 95％15 96％97％ 95％60 85％90％ 74％37 12091％91％ 76％18094％94％ 90％表1以输入DNA的百分数显示的肽标记DNA的部分PNA与DNA的结合反应简单、强烈且快速这种结合几乎不可逆，并且因此适合细胞转运过程与蛋白质比较，肽和PNA合成的费用不会太高并且可以容易且长时间地贮藏实施例3使用PNA-NLS转染在分裂细胞系中，与未经转运的DNA相比，转染DNA的主动核转运诱发其较快的表达假如该转染DNA在细胞质中存活时间足够长，则转染DNA在有和没有核转运试剂的快速分裂细胞中的表达速度应逐渐地接近其原因是留在细胞质中的转染DNA在细胞分裂过程中可以到达其核中使用阿非迪霉素可以大大降低细胞的分裂活性和转染能力主动核转运可消除这种转染效率降低的影响为了电穿孔，将5μg溶于水中的线性化载体-DNA在有或者没有25μMPNA-NLS(肽3NH2-(AEEA)10-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH)的最终体积10μl中在65℃下培养10分钟下面的步骤如实施例1中所述为了脂转染，将3μg溶于水中的载体-DNA在有或者没有25μM PNA-NLS(肽3)的最终体积10μl中在65℃下培养10分钟按照厂家说明用脂转染胺试剂(Life Technologies GmbH，Karlsruhe)进行转染为了基本上抑制CHO细胞的分裂，在没有血清情况下将细胞培养24小时，之后用血清和20μg/ml阿非迪霉素(Sigma-Aldrich Chemie GmbH，Deisenhofen)培养12小时所有随后的脂转染步骤都是在有20μg/ml阿非迪霉素的情况下进行的转染结果示于

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专利名称：转移核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途的制作方法图1中。虽然仅有几个细胞分裂，但是与存在于大多数表达载体中的序列偶联的两个电中性NLS在转染之后早期能够使转染细胞的百分数加倍。因使用阿非迪霉素细胞分裂速度降低而引起的转染效率的降低可以以这种方式消除。实施例4序列特异性结合NLS-融合蛋白使用大肠杆菌lac阻抑物的高亲和结合突变体作为序列特异性DNA-结合蛋白。该突变体对lac操纵基因序列具有10-15M的结合常数(Kolkhof，1992)。该高亲和力是通过丝氨酸61被亮氨酸替换实现的。这里所用的核转运蛋白缺失最后30个C-端氨基酸(位置331-360)并且位置330的亮氨酸被丝氨酸替换。这些突变蛋白形成同型二聚体，而不是同型四聚体，因此含有单个DNA-结合位点，而不是两个位点。但是也可以使用四聚体作为本发明的核转运剂。这些二聚体变体各自在N-端延伸作为一个NLS“N1D”NLS1MPKKKRKV-MKPVTLYDVA...“N2D”NLS2MEEDTPPKKKRKVEDL-KPVTLYDVA...(这些NLS-序列以黑体显示并且分别相应于SEQ ID NO8和SEQ IDNO9。序列MKPVTLYDVA...和KPVTLYDVA...表示上述大肠杆菌lac阻抑物。)NLS1相应于SV40病毒大T抗原的NLS。NLS2代表具有中性净电荷且由SV40-NLS和来自多瘤病毒VP2-蛋白的NLS的N-端侧翼区组成的杂种。lac-操纵基因-序列可以在大量表达载体中发现并且能够容易地与任意序列相连作为PCR引物的突出端。
实施例5含有NLS的lac-阻抑物突变体的DNA结合将以下lac-操纵基因-序列用于结合测定天然存在的操纵基因AATTGTGAGC GGATAACAATT和一完全回文操纵基因-序列AATTGTGAGC GCTCACAATT。
将0.7ng长1kb的放射性标记DNA-片段经限制性核酸内切酶裂解成914bp和86bp长的片段，然后在室温下分别用lac-阻抑物NLS-1-二聚体或NLS-2-二聚体培养30分钟。然后在聚丙烯酰胺凝胶上将这些片段分离(图2)。含有lac-操纵基因的86bp-片段因特异性结合而受到阻碍。非特异性结合导致缺乏lac-操纵基因的914bp-片段受到阻碍。在完全特异性结合的情况下，几乎观察不到任何非特异性结合。
其它实验证实，使用不同条件，例如在细胞培养基PPMI、150mM氯化钠或由10mM Tris/HCl(pH7.2)、10mM氯化钾和3mM乙酸镁的缓冲液中用两个测定的操纵基因-序列都达到了稳定的结合。
实施例6DNA通过lac-阻抑物-NLS的核转运将约8μg(100pmol)lac-阻抑物-NLS-突变体用2μg(100pmol)长30bp的双链DNA培养，在两端用荧光染料Cy5在室温下在总体积300μl的10mMTris/HCl(pH7.2)、10mM KCl、3mM乙酸镁和50μg/ml BSA中标记30分钟。通过一Microcon-filter(Amicon)离心将未结合的DNA分离。然后将样品缓冲液改变为细胞注射缓冲液(76mM K2HPO4，17mM KH2PO4，14mMNaH2PO4(pH 7.2))。
将一由与lac-阻抑物-突变体结合的DNA和荧光素标记的BSA(BSA-FITC)组成的混合物分别微量注射(带Femtotips的EppendorfTransjektor 5246，直径为0.5μm，注射压力为55hPa，注射时间为0.5秒)到50个NIH3T3-细胞中。注射10-15分钟之后，经荧光显微镜检查分析细胞(图3)。在成功注射到细胞质中之后，仅BSA-FITC留在细胞质中(1a、2a和3a)。与lac-阻抑物-NLS-突变体结合导致可以分析的几乎所有细胞，在少于15分钟(NLS1-二聚体，2b)和少于10分钟(NLS2-二聚体，3b)内分别将DNA转运到核中时，几乎没有DNA留在细胞质中。对照证实，没有结合蛋白质的标记DNA留在细胞质中(1b)。
实施例7用lac-阻抑物-NLS转染将1μg长1.1kb且含有一完全表达基因盒和后接一完全回文lac-操纵基因-序列的多腺苷酸序列的线性DNA在50μl等渗0.5×RPMI(用于脂转染)或150mM NaCl(用于使用聚乙烯亚胺的转染)中与不同浓度的lac-阻抑物-蛋白质(分别为约2.5μg、0.3μg和0.15μg二聚体，以及5μg、0.6μg或0.3μg四聚体)一起在室温下培养30分钟。按照厂家说明将样品与脂转染胺试剂(Life Technologies)或聚乙烯亚胺(PEI、ExGen 500、Fermentas)复合并添加到融合NIH3T3-细胞中。结果示于图4。
转染后4小时测定的转染效率可以由lac-阻抑物-NLS增加3-4倍。在本文所述的实施例中，转染前，培养粘着NIH3T3细胞至融合，使得细胞分裂大大受到抑制。转染后4小时，仅有几个细胞分裂。另外，由于以下事实使在本实施例中无论如何受到限制的分裂速度对转染有关的时间减少经胞吞作用摄取的转染DNA不得不留在胞内体和随后与阳离子转染试剂的复合物中，之后它可被转运到待表达的核中。脂转染胺试剂-DNA-复合物的存留时间可能要比与聚乙烯亚胺的DNA-复合物的存留时间明显长，这使得使用脂转染胺试剂的lac-阻抑物-NLS的作用不太清楚。24小时后大多数细胞分裂一次，此后有和没有核转运试剂的转染DNA的表达速度渐渐接近。
参考文献Batterson，W.、Furlong，D.和Roizman，B.(1983)“单纯疱疹病毒的分子遗传学。VIII.在释放病毒DNA和病毒再生循环的其它阶段有缺陷的温度敏感性突变体的进一步表征。”《病毒学杂志》45397Boulikas，T.(1993)“核定位信号(NLS)。”Crit.Rev.Euk.GeneExpr.3193Boulikas，T.(1996)“蛋白激酶和细胞周期蛋白的核输入。”《细胞生物化学杂志》6061Boulikas，T.(1997)“DNA修复蛋白的核输入。”《抗癌研究》17843Chen，Y.-R.、Lees-Miller，S.P.、Tegtmeyer，P.和Anderson，C.W.(1991)“在氨基和羧基末端位置人DNA激活的蛋白激酶磷酸化猿猴病毒40T抗原。”《病毒学杂志》655131Citovsky，V.、Warnick，D.和Zambryski，P.(1994)“土壤杆菌VirD2和VirE2蛋白在玉米和烟草中的核输入。”《美国国家科学院院报》913210Collas，P.、Husebye，H.和Alestr?m，P.(1996)“SV40 T抗原的核定位序列促进转基因摄取以及在斑马鱼胚胎核中的表达。”《突变研究》5451Collas，P.和Alestr?m，P.(1996)“SV40 T抗原的核定位信号在体外指导质粒DNA输入到海胆雄性原核中。”Mol.Repr.Dev.45431Collas，P.和Alestr?m，P.(1997a)“通过SV40 T抗原的核定位信号将质粒DNA快速导向斑马鱼胚胎核中。”Mol.Mar.Biol.Biotech.648Collas，P.和Alestr?m，P.(1997b)“核定位信号在斑马鱼中核转运质粒DNA的驱动力。”Biochem.Cell.Biol.75633Dowty，M.E.、Williams，P.、Zhang，G.、Hagstrom，J.E.和Wolff，J.A.(1995)“质粒进入原始大鼠肌管的分裂期后核中。”《美国国家科学院院报》924572Ellison，V.和Brown，P.O.(1994)“在整合酶和病毒DNA端之间的一稳定复合物在体外介导人免疫缺陷病毒整合。”《美国国家科学院院报》917316Emi，N.、Kidoaki，S.、Yoshikawa，K.、Saito，H.(1997)“经多精氨酸介导的基因转移需要形成DNA聚集体的大载体-复合物。”Biochem.Biophys.Res.Commun.231421-424Fieck，A.、Wyborski，D.L.和Short，J.M.(1992)“用于在真核细胞中表达的大肠杆菌Lac阻抑物的修饰核信号序列对蛋白质活性和核累积的影响。”《核酸研究》201785Friedmann，T.(1994)“神经病症的基因疗法。”《遗传学趋势》10210Friedmann，T.(1996)“人基因疗法-一种未成熟基因，但是一定不在瓶中。”《天然药物》2144Fritz，J.D.、Herweijer，H.、Zhang，G.和Wolff，J.A.(1996)“使用组蛋白凝聚的质粒DNA将基因转移到哺乳动物细胞中。”《人基因疗法》71395Gallay，P.、Stitt，V.、Mundy，C.、Oettinger，M.和Trono，D.(1996)“karyopherin途径在I型人免疫缺陷病毒核输入中的作用。”《病毒学杂志》701027Greber，U.F.、Willetts，M.、Webster，P.和Helenius，A.(1993)“腺病毒2在进入细胞过程中逐步分解。”《细胞》75477G?rlich，D.、Henklein，P.、Laskey，R.A.和Hartmann，E.(1996)“输入素-a中的一41个氨基酸基元能与输入素-b结合，由此转运到核中。”《EMBO杂志》151810G?rlich D.(1998)“向细胞核中转运和从细胞核中运出。”《EMBO杂志》172721Jans，D.A.、Ackerfmann，M.J.、Bischoff，J.R.、Beach，D.H.和Peters，R.(1991)“在T124的p43cdc2-介导的磷酸化抑制了SV-40 T抗原蛋白的核输入。”《细胞生物学杂志》1151203Kaneda，Y.、Iwai，K.和Uchida，T.(1989)“在成年大鼠肝脏中与核蛋白共引入的DNA的增量表达。”《科学》243375Kolkhof，P.(1992)“3个牢固结合的Lac阻抑物的特异性。”《核酸研究》205035Lanford，R.E.、Kanda，P.、Kennedy，R.C.(1986)“用与SV40 T抗原转运信号同源的合成肽诱导核转运。”《细胞》46575-582Mistry，A.R.、Falciola，L.、Monaco，L.、Tagliabue，R.、Acerbis，G.、Knight，A.、Harbottle，R.P.、Soria，M.、Bianchi，M.E.、Coutelle，C.和Hart，S.L.(1997)“在巴斯德毕赤氏酵母中产生的重组HMG1蛋白一种非病毒基因转运剂。”《生物技术》22718Nakanishi，A.、Clever，J.、Yamada，M.、Li，P.P.和Kasamatsu，H.(1996)“与衣壳蛋白结合启动猿猴病毒40 DNA核导向。”《美国国家科学院院报》9396Naldini，L.、Bl?mer，U.、Gallay，P.、Ory，D.、Mulligan，R.、Gage，F.H.、Verma，I.M.、Trono，D.(1996)“通过慢病毒载体在体内转运基因和稳定转导非分裂性细胞。”《科学》272263Neumann，G.、Castrucci，M.R.和Kawaoka，Y.(1997)“流感病毒核蛋白的核输入和输出。”《病毒学杂志》719690Nielson，P.、Egholm，M.、Berg，R.H.和Buchardt，O.(1991)“通过用一胸腺嘧啶取代的聚酰胺的链替换序列选择性地识别DNA。”《科学》2541497Niidome，T.、Ohmori，N.、Ichinose，A.、Wada，A.；Mihara，H.、Hirayama，T.；Aoyagi，H.(1997)“阳离子α-螺旋肽与质粒DNA的结合及其向细胞中的基因转移能力。”《生物化学杂志》27215307-15312Rihs，H.-P.和Peters，R.(1989)“核转运动力学取决于含磷酸化位点且侧翼有猿猴病毒40 T抗原的亲核序列。”《EMBO杂志》81479Rihs，H.-P.、Jans，D.A.、Fan，H.和Peters，R.(1991)“通过侧翼有SV40 T-抗原的核定位序列的酪蛋白激酶II位点测定核细胞质蛋白转运的速度。”《EMBO杂志》10633Shuman，S.(1994)“使用牛痘DNA拓扑异构酶分子克隆和多核苷酸合成的新方案。”《生物化学杂志》26932678Sebastyén，M.G.、Ludtke，J.J.、Bassik，M.C.、Zhang，G.、Budker，V.、Lukhtanov，E.A.、Hagstrom，J.E.和Wolff，J.A.(1998)“DNA载体化学信号肽与质粒DNA的共价结合。”《天然生物技术》1680Sorgi，F.L.、Bhattacharya，S.、Huang，L.(1997)“硫酸鱼精蛋白促进脂类介导的基因转移。”《基因疗法》4961-968Trubetskoy，V.S.、Budker，V.G.、Hanson，L.J.、Slattum，P.M.、Wolff，J.A.、Hagstrom，J.E.(1998)“利用模板聚合作用自装配DNA-聚合物复合物。”《核酸研究》264178-4185Wadhwa，M.S.、Collard，W.T.、Adami，R.C.、McKenzie，D.L.、Rice，K.G.(1997)“肽介导的基因转运肽结构对基因表达的影响”《生物缀合化学》881-88Wang，P.、Palese，P.和O’Neill，R.E.(1997)“在A型流感病毒核蛋白上的NPI-1/NPI-3(Karyopherin a)结合位点为一非常规核定位信号。”《病毒学杂志》711850Weiss，K.、Ryder，U.和Lamond，A.I.(1997)“hSRPla的保守氨基端结构域对核蛋白输入是必不可少的。”《EMBO杂志》151818Wilke，M.、Fortunati，E.、van den Broek，M.、Hoogeveen，A.T.和Scholte，B.J.(1996)“肽基转运系统的功效取决于有丝分裂活性。”《基因疗法》311133-1142Xiao，C.-Y.、Hübner，S.和Jans，D.A.(1997)“通过侧翼有核定位序列的双链DNA-依赖性蛋白激酶位点(丝氨酸120)调节SV40大肿瘤抗原核输入。”《生物化学杂志》27222191Yoneda，Y.、Arioka，T.、Imamoto-Sonobe，N.、Sugawa，H.、Shimonishi，Y.、Uchida，T.(1987)“在核定位中所涉及的含SV40大T-抗原区的合成肽指导蛋白质向核中转运。”《细胞研究实验》170439-452Yoneda，Y.、Semba，T.、Kaneda.Y.、Noble，R.L.、Matsuoka，Y.、Kurihara，T.、Okada，Y.和Imamoto，N.(1992)“含有核定位信号及其SV40 T-抗原的侧翼序列的长合成肽有效地指导IgM向核中转运。”《细胞研究实验》201313引证的专利Dzau，V.J.和Kaneda，Y.(1997)“通过脂质体在体内转运治疗剂的方法。”N no.5631237Gerhard，F.、Kuhn C-S.、Mittenbühler，K和AppelK.(Offenlegungsschrift vom 1997年5月15日)DE19541679A1Gopal，T.V.(1997)“肽介导的基因转移”US5670347Hawley-Nelson，P.、Lan，J.、Shih，P.J.、Jessee，J.A.和Schifferli，K.P.(1998)“肽强化的阳离子脂转染”US5736392Nielson，P.E.、Buchardt，O.、Egholm，M.和Berg，R.H.(1996)“肽核酸”US5539082Szoka，F.C.Jr.“自装配的多核苷酸转运系统”(PCT，1993年10月14日)WO93/19768，其中的权利要求23-27
序列表<110>AMAXA GmbH<120>转运核酸通过核被膜的细胞转运系统的用途<130>201-1(1)<140><141><150>DE 199 00 513.3<151>1999-01-08<150>DE 199 33 939.2<151>1999-07-20<160>9<210>1<211>21<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>1Gly Lys Pro Thr Ala Asp Asp Gln His Ser Thr Pro Pro Lys Lys Lys15 10 15Arg Lys Val Glu Asp20<210>2<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 25<210>3<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA为PNA(肽核酸)<400>3cctttctccc ttc 13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA为PNA(肽核酸)<400>4ctcttccttt ttc13<210>5<211>17<212>DNA/PRT<213>人工序列<220><223>DNA为PNA；混合肽/PNA序列<400>5ccttt Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly tttcc 17<210>6<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>DNA为PNA<400>6ctcttccttt ttc13<210>7<211>27<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>7Gly Lys Pro Ser Ser Asp Asp Glu Ala Thr Ala Asp Ser Gln His Ser15 10 15Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp20 25<210>8<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>序列相应于SV40病毒大T抗原的NLS<400>8Met Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val15<210>9<211>16<212>PRT<213>人工序列<220><223>序列相应于由SV40 NLS和来自多瘤病毒VP2蛋白的NLS的N-端侧翼区组成的中性杂种<400>9Met Glu Glu Asp Thr Pro Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Leu15 10 1

本发明涉及一种核转运剂、一种含有所述核转运剂的基因转移系统、一种使用所述核转运剂将DNA转运到真核细胞核中的方法以及所述核转运剂在治疗癌症、病毒感染、神经系统疾病、移植排斥和单基因或多基因遗传疾病的基因疗法中的用途。

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