具有增强的生物学效用的干扰素-β的聚合物缀合物制作方法

梅瑞·R·歇尔曼, 艾尔·D·威廉斯, 艾雷沙·L·马丁纳, 马克·G·P·塞佛

2012年1月18日

2003年12月23日

2002年12月26日

山景医药公司

A61P25/28GK102319437SQ20111022433

干扰素 效用 生物学 增强 具有

1.一种增加非糖基化干扰素β的生物效力的方法，包含选择性地偶联一种或多种合成的水溶性聚合物至该干扰素β的氨基末端氨基酸上，其中该氨基-末端氨基酸位于该干扰素β的受体-结合功能域的远端2.权利要求1的方法，其中该生物效力在响应于干扰素β的细胞培养测定法中测量3.权利要求1的方法，其中该一种或多种聚合物选自一种或多种聚亚烷基二醇类、一种或多种聚环氧烷、一种或多种聚乙烯醇、一种或多种聚羧酸酯、一种或多种聚(乙烯基吡咯烷酮)、一种或多种聚(氧亚乙基-氧亚甲基)、一种或多种聚(氨基酸)、一种或多种聚丙烯酰基吗啉、一种或多种酰胺以及一种或多种烯化氧的一种或多种共聚物、一种或多种葡聚糖以及一种或多种透明质酸4.权利要求1的方法，其中该干扰素β具有SEQID NO 1所示的干扰素-β -Ib的氨基酸序列5.权利要求1的方法，其中该干扰素β基本具有SEQID NO 1的氨基酸序列6.权利要求1的方法，其中该聚合物共价偶联至该氨基末端氨基酸的α氨基上7.权利要求6的方法，其中该聚合物与该α氨基的共价偶联是经由仲胺连接的8.权利要求1的方法，其中该聚合物偶联至该氨基末端氨基酸的化学反应性侧链基团上9.权利要求8的方法，其中该反应性侧链是醛基，其是通过选择性氧化裂解干扰素β 的氨基末端丝氨酸残基而引入的10.权利要求3的方法，其中该聚合物是聚亚烷基二醇11.权利要求10的方法，其中该聚亚烷基二醇选自聚(乙二醇)、单甲氧基聚(乙二醇)以及单羟基-聚(乙二醇)12.权利要求11的方法，其中该聚亚烷基二醇是单甲氧基聚(乙二醇)13.权利要求11的方法，其中该聚亚烷基二醇是单羟基聚(乙二醇)14.权利要求10的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为lkDa-lOOkDa15.权利要求14的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为8kDa-14kDa16.权利要求14的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为10kDa-30kDa17.权利要求16的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为18kDa-22kDa18.权利要求17的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为20kDa19.权利要求14的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为30kDa20.权利要求1的方法，其中该聚合物在该氨基末端氨基酸处偶联至该干扰素β上模仿了该干扰素β糖基化作用或过糖基化作用的有利效应21.一种缀合物，由权利要求1的方法产生22.—种药物组合物，包含一种或多种权利要求21的缀合物及一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体23.一种缀合物，包含在其氨基末端氨基酸处共价偶联至一种或多种合成的水溶性聚合物上的干扰素β，其中该干扰素β与未如此偶联的相同干扰素β相比其生物效力有所增加24.一种缀合物，包含在其氨基末端氨基酸处共价偶联至一种或多种合成的水溶性聚合物上的干扰素β，其中该干扰素β缀合物的生物效力与其中一种或多种相同的合成水溶性聚合物随机偶联至溶剂可接近的赖氨酸残基上的相同干扰素β的缀合物的生物效力相比有所增加25.权利要求23或M的缀合物，其中该缀合物的生物效力在响应于干扰素β的细胞培养测定法中测量26.权利要求23或M的缀合物，其中该干扰素β具有SEQID NO 1中所示的干扰素-β-Ib的氨基酸序列27.权利要求沈的缀合物，其中该干扰素-β-lb的生物效力增加至约等于具有SEQID NO 2所示氨基酸序列且于天冬酰胺残基80处糖基化的干扰素- β -Ia的效力28.权利要求25的缀合物，其中所述响应于干扰素β的细胞培养测定法选自抗增殖测定法、抗病毒测定法、信号传导测定法以及基因活化测定法29.权利要求23或M的缀合物，其中该一种或多种聚合物选自一种或多种聚亚烷基二醇类、一种或多种聚环氧烷、一种或多种聚乙烯醇、一种或多种聚羧酸酯、一种或多种聚 (乙烯基吡咯烷酮)、一种或多种聚(氧亚乙基-氧亚甲基)、一种或多种聚(氨基酸)、一种或多种聚丙烯酰基吗啉、一种或多种酰胺以及一种或多种烯化氧的一种或多种共聚物、 一种或多种葡聚糖以及一种或多种透明质酸30.权利要求23或M的缀合物，其中该聚合物共价偶联至该干扰素β的氨基-末端氨基酸的α氨基上31.权利要求30的缀合物，其中该聚合物经由仲胺连接共价偶联至该α氨基上32.权利要求23或M的缀合物，其中该聚合物偶联至该氨基末端氨基酸的化学反应性侧链基团上33.权利要求32的缀合物，其中该反应性侧链是醛基，其是通过干扰素β氨基末端丝氨酸残基的选择性氧化裂解而引入的34.权利要求23或M的缀合物，其中该水溶性聚合物是聚亚烷基二醇35.权利要求34的缀合物，其中该聚亚烷基二醇选自聚(乙二醇)、单甲氧基聚(乙二醇)以及单羟基聚(乙二醇)36.权利要求35的缀合物，其中该聚亚烷基二醇是单甲氧基聚(乙二醇)37.权利要求35的缀合物，其中该聚亚烷基二醇是单羟基聚(乙二醇)38.权利要求34的缀合物，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为lkDa-lOOkDa39.权利要求38的缀合物，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为8kDa-14kDa40.权利要求38的缀合物，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为10kDa-30kDa41.权利要求40的缀合物，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为18kDa-22kDa42.权利要求41的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为20kDa43.权利要求38的方法，其中该聚亚烷基二醇具有的分子量约为30kDa44.权利要求23或M的缀合物，其中该聚合物在该氨基末端氨基酸处偶联至该干扰素 β上模仿了该干扰素β的糖基化作用或过糖基化作用的有利效应45.一种药物组合物，包含权利要求21、23以及M中任何一项的缀合物以及药学上可接受的载体或赋形剂46.一种试剂盒，包含权利要求21的缀合物47.一种试剂盒，包含权利要求23或M的缀合物48.一种试剂盒，包含权利要求22的药物组合物49.一种试剂盒，包含权利要求45的药物组合物50.一种预防、诊断、或治疗患有或易患有干扰素β响应性身体病症的动物中所述身体病症的方法，包括给所述动物施用有效量的权利要求21、23和25中任一项的缀合物51.一种预防、诊断、或治疗患有或易患有干扰素β响应性身体病症的动物中所述身体病症的方法，包括给所述动物施用有效量的权利要求22或45的药物组合物52.权利要求50的方法，其中该动物是哺乳动物53.权利要求51的方法，其中该动物是哺乳动物54.权利要求52或53的方法，其中该哺乳动物是人55.权利要求50的方法，其中该干扰素β响应性身体病症选自癌症、传染病、神经变性病症、自体免疫病症以及遗传疾病56.权利要求55的方法，其中该癌症选自乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、 肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、神经癌症、头部以及颈部癌症、皮肤癌、癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤57.权利要求55的方法，其中该干扰素β响应性传染病选自病毒性肝炎、亲心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病58.权利要求55的方法，其中该干扰素β响应性神经变性疾病是多发性硬化59.权利要求58的方法，其中该多发性硬化选自复发-缓解性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化以及继发性进行性多发性硬化60.权利要求51的方法，其中该干扰素β响应性身体病症选自癌症、传染病、神经变性病症、自体免疫病症以及遗传疾病61.权利要求60的方法，其中该癌症选自乳腺癌、子宫癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、 肺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、胃肠的癌症、胰腺癌、膀胱癌、肾癌、骨癌、神经癌症、头部以及颈部癌症、皮肤癌、癌、肉瘤、腺瘤以及骨髓瘤62.权利要求60的方法，其中该干扰素β响应性传染病选自病毒性肝炎、亲心性病毒以及HIV/AIDS引起的疾病63.权利要求60的方法，其中该干扰素β反应性神经变性病症是多发性硬化64.权利要求63的方法，其中该多发性硬化选自复发-缓解性多发性硬化、原发性进行性多发性硬化以及继发性进行性多发性硬化65.一种用于测定以还原性烷基化合成的聚合物-蛋白质缀合物中连接到具有N-末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质的氨基末端上的聚合物数量的方法，该方法包括a)将所述缀合物和充分量的氧化剂反应充分的时间使该聚合物从丝氨酸或苏氨酸残基裂解下来；以及b)测量该制剂中非缀合蛋白质部分的增加量66.权利要求65的方法，其中该蛋白质是细胞因子67.权利要求66的方法，其中该细胞因子是干扰素β68.权利要求66的方法，其中该细胞因子是巨核细胞生长和发生因子69.权利要求65的方法，其中该氧化剂包含高碘酸盐，其选自偏高碘酸钠、偏高碘酸钾、偏高碘酸锂、高碘酸钙、高碘酸钡以及高碘酸70.权利要求65的方法，其中该测量是以一种或多种选自下列的方法进行的大小-排阻层析法、反相层析法、凝胶电泳法、毛细管电泳法、超速离心法、超滤法、光散射以及质谱法71.一种用于选择性氧化裂解生物活性蛋白质的N-末端丝氨酸或苏氨酸残基、而不氧化该生物活性蛋白质的功能必需氨基酸残基的方法，包括a)调节该生物活性蛋白质溶液的氢离子浓度至pH介于约7至约8之间；b)将该生物活性蛋白质溶液以每摩尔生物活性蛋白质对约0.5至约5摩尔高碘酸盐的比例与高碘酸盐混合；以及c)令该混合物在温度介于约2°C至约40°C之间温育至少一个小时72.权利要求71的方法，其中该生物活性蛋白质是干扰素β73.权利要求72的方法，其中该干扰素β为具有SEQID NO 1所示氨基酸序列的干扰素-β-lb74.—种增加干扰素-β -Ib制剂的生物效力的方法，包括从该干扰素-β -Ib制剂中除去一种或多种抑制性成分75.权利要求74的方法，其中使用一种或多种层析法从该干扰素-β-Ib制剂中除去一种或多种抑制性成分，该层析法选自大小排阻层析法、反相层析法、疏水性相互作用层析法以及亲和层析法76.权利要求74的方法，其中该干扰素-β-Ib制剂的生物效力是在响应于干扰素β 的细胞培养测定法中测量的77.权利要求76的方法，其中该干扰素β响应性细胞培养测定法选自抗增殖测定法、抗病毒测定法、信号传导测定法以及基因活化测定法

本发明属于蛋白质生物化学及药学和医学领域具体而言，本发明提供一种由水溶性聚合物(例如聚(乙二醇)及其衍生物)联结细胞因子(例如β干扰素)产生缀合物的方法，相较于以标准合成方法合成的相同细胞因子的聚合物缀合物，该缀合物的效能增加本发明也提供依该方法制作的缀合物，包含该缀合物的组合物，包含该缀合物以及组合物的试剂盒以及使用该缀合物和组合物预防、诊断以及治疗各种医学和兽医病症的方法本发明也提供在某些条件下还原烷化以确定聚合物附着位点的方法相关技术下列相关技术的描述包括解释本案不属于现有技术的部份细胞因子是一种分泌的调控蛋白，其以内分泌、旁分泌或自分泌的方式控制细胞的生存、生长、分化、和/或效应物功能(参见 Nicola, N. Α. (1994) in =Guidebook to Cytokines and Their Receptors, Nicola, N. A.，ed.，pp. 1-7, Oxford University Press, New York)由于细胞因子的效能、 特异性、分子小以及较易在重组生物体中产生，因此具有许多潜在的治疗剂用途细胞因子及重组蛋白质作为治疗剂在发展上有二个重大阻碍其在循环系统中的半衰期短及潜在的抗原性和免疫原性在本文及在本领域中，术语"抗原性"意指分子结合于已存在的抗体的能力，而术语"免疫原性"意指分子在活体内唤起免疫反应的能力， 不论该反应是否涉及形成抗体("体液反应")或刺激细胞免疫反应施用重组型治疗性蛋白质时，为了达到最高循环活性及减少生物利用度和降解方面的问题，经常采取静脉内(i.v.)施用然而，以i. v.施用后，小蛋白质的半衰期通常极短(参阅例如 Mordenti，J.，等人，(1991)Pharm Res 8 1351-1359 ；Kuwabara, T.，等人，(1995)Wiarm Res 121466-1469)一般而言，健康的肾脏可保留血液中水动力半径大于血清白蛋白(即Mokes半径约0. 36人以及分子量约66，000道尔顿，66kDa)的蛋白质然而，较小型的蛋白质，包括细胞因子，例如粒细胞集落刺激因子(“G-CSF“)、 白细胞介素-2("白细胞介素2")、干扰素干扰素-α")以及干扰素-γ ("干扰素1 “)，则经肾小球的过滤快速地从血流中消除(Brenner, B. Μ.，等人，(1978)Am J Physiol 234 F455-F460 ；Venkatachalam, Μ. Α.等人，(1978) Circ Res 43337-347; Wilson,G.，(1979) J Gen Physiol74 495-509 ；Knauf,M. J.，等人，(1988) J Biol Chem263 15064-15070 ；Kita, Y.，等人，(1990)Drug Des Deliv6 157-167 ；Rostaing, L.，等人， (1998)，J Am Soc N印hrol9 2344-2348)结果，不易在施用后使循环中保有适当治疗浓度的重组型小蛋白质因此，一般必须施用较高浓度的蛋白质且注射次数更频繁该方式产生的疗程使治疗成本提高，降低病人的顺服性并增加副作用的风险，例如免疫反应细胞以及体液免疫反应会使在循环系统中重组蛋白质的注射浓度减低，以致于抵消施用有效剂量，或导致影响治疗成效的情形，包括清除加速、中和功效及过敏性反应(Ragnhammar，P.，等人，(1994)Blood 84 4078-4087 ；ffadhwa,M.，等人，(1999)Clin Cancer Res 5 1353-1361 ； Hjelm Skog，A.-L.，等人，(2001)Clin Cancer Res 7 1163-1170 ;Li，J.，等人，(2001) Blood 98 3241-3248 ；Basser, R. L.，等人，(2002) Blood99 2599-2602 ；Schellekens, H.， (2002)Clin Ther 241720—1740)目前已有许多研究着力于通过聚(乙二醇)(〃 PEG")的共价附着来修饰重组蛋白质以改善上述缺点(评估于 Sherman，M.R.，等人，(1997) in =Poly (ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, Harris, J. Μ., 等人’ eds. , pp.155-169, American Chemical Society, Washington, D. C. ；Roberts, M. J.,等人，(2002)Adv Drug Deliv Rev M 459-476)将PEG附着在蛋白质上已显示能在活体内稳定蛋白质，改良其生物利用度和/或减低其免疫原性(PEG共价附着至蛋白质或其它底物，在本文中以及本领域中称为"PEG化作用")此外，PEG化作用可显著的增加蛋白质的水动力半径当小蛋白质，例如细胞因子，偶联至单一长链的PEG(例如，其分子量至少约ISkDa)，所产生的缀合物的水动力半径大于血清白蛋白，其经由肾小球自循环系统中清除会显著减缓PEG化的组合效应蛋白质水解降低、免疫识别降低以及肾清除速率降低，均赋予PEG化蛋白质作为治疗剂的实质优点自1970年代以来即已尝试使用共价附着聚合物来改良各种医药用蛋白质的安全性和功效(参阅，例如Davis, F. F.，等人，U. S. Patent No. 4，179，337)一些实例包括将 PEG或聚(环氧乙烷)(〃 ΡΕ0")偶联至腺苷脱氨酶(EC 3. 5. 4. 4)以治疗重症联合免疫缺陷疾病(Davis, S.，等人，(1981) Clin Exp Immunol 46 649-652 ；Hershf ield, Μ. S.，等人， (1987)N Engl J Med 316589-596)；偶联至超氧化物岐化酶(EC 1.15.1.1)以治疗炎性病症(Saifer，Μ.，等人，美国专利第5，006, 333以及5，080, 891号)以及偶联至尿酸氧化酶(EC 1.7.3.3)以从血液和尿液中去除过量的尿酸(Kelly，S.J.，等人，Q001)J Am Soc Nephrol 12 1001-1009 ;Williams，L. D.，等人，PCT 公告第 WO 00/07629A 3 号以及美国专利第 6，576，235 号；Sherman，Μ. R.，等人，PCT 公告第 WO 01/59078 A2 号)PEOs以及PEk是一种由共价联结的环氧乙烷单位所组成的聚合物此类聚合物有下列的一般结构R1-(OCH2CH2)n-R2其中&可为羟基(或其反应性的衍生物)，而R1可为氢(如二羟基PEG(" PEG diol")中的)、甲基(如单甲氧基PEG(" mPEG")中的)、或其它低级烷基，例如异丙氧基 PEG或叔丁氧基PEG中的PEG通式的参数η为聚合物中环氧乙烷单位的数目，在本文及在本领域中是指"聚合度"相同通式的聚合物(其中R1SCh7烷基团)，也称为环氧乙烷衍生物(Ya sukohchi,T.，等人，美国专利第6，455，639号)PEGs以及PEOs可为线性、分支(Fuke, I.，等人(1994) J Control Release30 27-34)或星形状(Merrill, E. W. (1993) J Biomater Sci Polym Ed 51-11)PEGs以及PEOs是两性化合物，即其可溶解于水和某些有机溶剂中，且其可黏附至内含脂质的材料，包括有包膜病毒及动物和细菌细胞的细胞膜 某些环氧乙烷(OCH2CH2)以及具有下列结构的环氧丙烷的随机或嵌段或交替共聚物