专利名称：一种诱导产生Ⅲ型干扰素-λ1的方法III型干扰素(IFN)是最近发现和报道的一种新的干扰素家族，具有和I、II型干扰素类似的生物学活性。IFN-λ 1是III型干扰素的一种，基因位于人类19号染色体，转录得到的mRNA长度为856bp，开放式阅读框为长60;3bp。IFN- λ 1通过作用于细胞表面受体发挥其生物学活性。IFN-λΙ的受体由两条链构成，第一条链(IFNLRl)是IFNX特异的，第二条链(IL10R2)是IL-IO、IL-22和IL46受体共有的。IFN-λ s结合其受体后，主要激活JAK/ STAT通路。IFN- λ 1与受体复合物结合形成三聚体使得Janus激酶(Jakl和Jak2)活化， 随后IFN-λ Rl I⑶酪氨酸磷酸化，激活潜在的转录因子(STAT1和STAT2)。最终启动下游功能基因如2，，5，-OAS 1/2, MxA和PKR等的表达。IFN- λ 1的生物学功能主要包括三个方面第一，抗病毒活性。研究证明，IFN-λ 1 具有广谱的抗病毒效果，对多种病毒的表达和复制有明显的抑制作用，报道的病毒类型有， 乙型肝炎病毒(HBV)单纯疱疹病毒-2 (HSV-2)西尼罗河病毒和丙型肝炎病毒(HCV)水疱性口炎病毒(VSV)甲型流感病毒(IAV)和汉坦病毒(HTNV)。IFN-λ 1还能降低多种病毒的复制或病毒感染引起的细胞病变效应。第二，IFN-λ s具有抗增殖活性和抗肿瘤作用，IFN-λ 1 能够激活宿主抗肿瘤机制以抑制某些种类的肿瘤的生长。第三，免疫调节活性。IFN-λ 1免疫调节功能包括增加NK细胞和T细胞毒性，促进Thl反应，上调肿瘤细胞中的MHC I分子而促进抗原呈递以及介导细胞凋亡。因此，I型干扰素如IFN-α、IFN-β等在临床上的应用已经非常广泛，而作为一种新发现的干扰素，IFN-λ 1在临床上的应用还未完全推广。基于 IFN-λ 1具有和I型干扰素相似的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，但却通过不同受体起作用，因此IFN-λ 1可作为除I型干扰素外另一治疗选择。且最近的研究表明IFN-λ 1没有明显的免疫介导作用，与I型干扰素相比引起的毒负所用更小。因此，IFN-λ 1在临床上的具有非常广阔的应用前景。IFN-λ 1主要是在病原微生物感染时在宿主的免疫反应过程中被诱导表达。人类的IFN-λ 1并非组成型表达的，通常情况下该基因是不表达的。单链RNA病毒如甲型流感、 仙台病毒、新城疫病毒和双链DNA病毒都能诱导IFN-λ 1基因表达；细菌感染时，细菌的脂多糖也能诱导机体的免疫细胞表达该基因；最近的研究显示屋尘螨抗原刺激的原代支气管上皮细胞所产生的IFN-λ 1水平与病毒诱导的相当。目前在体外产生IFN-λ 1的技术方法主要是原核表达。即利用分子生物学技术克隆IFN-λ 1基因编码序列，构建到原核表达载体，在原核细胞内进行表达。用病源微生物诱导细胞表达IFN-λ 1，提取细胞总mRNA，逆转录PCR成cDNA，用设计好的特异性引物进行 PCR扩增，得到该基因的编码区基因序列，构建到原核表达载体中，用原核生物进行表达。例如，将构建好的原核表达质粒转化进大肠杆菌，然后大量培养该细菌，用原核表达的诱导剂如IPTG诱导，细菌即可表达产生IFN-λ 1。该方法的优点是，细菌培养的设备简单、成本低，可大量表达IFN-λ 1。但有无法避免的诸多缺点一、细菌表达的蛋白分子存在于细菌的细胞内，要想得到表达的蛋白必须破细胞，细胞裂解液中存在全部的细菌自身蛋白，要从这种混合物中分离纯化才能得到较为纯净的目的蛋白；二、为了分离纯化的需要，表达的分子必须融合进标签序列，即表达出来的蛋白是目的蛋白加标签的组合体，这种标签会影响产物的生物学活性；三、因原核生物与真核生物基因表达系统和机制的不同，会导致表达的产物产生错误折叠、错误修饰等直接影响产物的生物学活性，甚至完全没有生物学活性。目前，在真核细胞中诱导表达IFN-λ 1的方法非常少，且有很大的局限性。利用病源微生物或病源微生物的某一组分诱导细胞系或原代细胞可表达产生IFN-λ 1。例如，从血液中分离出单核细胞，用人源重组的粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介素-4 (IL-4)刺激其分化为成熟的树突状细胞(DC)，再用A型流感病毒感染该细胞，被病毒感染的DC细胞会表达产生IFN-λ 1。用细菌的脂多糖(LPS)或模拟病毒双链RNA的Poly I:C 刺激免疫细胞，如DC或PBMC，也可产生IFN- λ 1.该方法可产生具有完整生物学活性的 IFN-λ 1，其缺点是:Α、因需利用病源微生物或其致病成分作为诱导因素，应用过程中存在危险因素；B、该技术中被感染或刺激的细胞会产生复杂的天然免疫反应和炎症反应，甚至发生凋亡，细胞在病理过程中其它的细胞因子也开始了大量表达，如肿瘤致死因子-α (TNF-α )、IFN-α、IFN-β、白介素-18 (IL-18), IFN-γ等，产生大量的杂副产物，增加了该技术的应用难度。
本发明所要解决的技术问题是提供一种在真核细胞中诱导表达IFN-λ 1的方法， 产物与现有技术相比更为较纯净。为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案以表达纯化的人源重组白介素-32蛋白作为诱导剂，刺激人外周血单个核细胞或其衍生的细胞系用于产生干扰素-λ 1。更具体地，从全血或血液利用后的废弃组分中分离得到人外周血单个核细胞，并对其在体外进行培养；构建IL-32原核表达质粒，并诱导表达、纯化、去内毒素；在人外周血单个核细胞培养体系中加入表达纯化的人源重组白介素-32，刺激PBMC大量表达IFN-λ 1并分泌到细胞外的培养基中。作为优选的方案，IL-32蛋白的浓度在5ng/ml之上； IL-32蛋白刺激PBMC的时间在M小时之上。从血液利用后的废弃组分中分离得到人外周血单个核细胞的过程如下利用PBMC与血液废弃组分中其他成分(血小板、红细胞等)的密度不同，采用商用的人淋巴细胞分离液，用离心沉降的方法，从全血中将PBMC分离出来并洗涤。IL-32原核表达载体的构建、诱导表达、纯化过程如下设计特异性的引物SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2，将IL-32的编码序列构建到商用的原核表达载体petjSa中；将原核表达质粒转化进大肠杆菌，用IPTG诱导表达IL-32.裂解细菌后，利用商用M柱纯化，得到较为纯净的人源重组IL-32 ；利用商用去内毒素试剂， 除去内毒素；人源重组IL-32大小为15-27 kD,利用规格为10 kD和50 kD超滤管进行进一步的纯化，得到纯净的人源重组IL-32 (图2)。本发明在PBMC的体外培养体系中分别加入浓度分别为1、5、10 ng/ml (质量体积比)的人源重组IL-32，继续培养M小时后，在收集到的PBMC培养基上清液中，我们采用酶联免疫反应的方法利用商业化的IFN-λ 1检测试剂盒，对诱导产生的IFN-λ 1蛋白绝对含量进行检测，人源重组的IL-32浓度为5ng/ml (质量体积比)诱导M小时后，PBMC上清中IFN-λ 1含量高达160pg/ml (质量体积比)(图5)。诱导方法的特异性和效率检测。将IFN-λ 1的启动子和IL-32真核表达载体进行共转染后发现IL-32可显著性激活IFN-λ 1启动子的活性，但不能激活IFN-β启动子(图3)。 分别用1、5、10 ng/ml (质量体积比)的人源重组IL-32刺激PBMC M小时后，收集PBMC 细胞，用TRIzoI溶解后，提取细胞总mRNA，利用IFN-λ 1特异性检测引物进行real-time PCR,结果显示IFN- λ 1的mRNA大量表达，当人源重组IL-32浓度为5ng/ml时，比诱导前水平高30倍以上，而IFN-α、IFN-β的mRNA水平均无明显升高(图4)。这说明该方法诱导 IFN- λ 1的高效性，也说明IL-32可作为的IFN-λ 1特异性诱导剂。产物活性检测。蛋白质的多肽链在合成过程中折叠方式非常复杂，肽链合成后的空间构造受环境的影响会存在多变性，合成过程中会添加不同的修饰。无论是生物学方法诱导表达还是人工化学方法合成的蛋白质，虽然可以保证肽链线性序列的正确，但往往会因为技术的局限性而导致合成的蛋白分子折叠错误和修饰异常。这种与生物体内自然产生的蛋白相比构象和修饰不同的合成蛋白质，有的导致了降低原本的生物学活性，有的完全失去甚至出现相反的生物学活性。因此，对诱导产生的IFN-λ 1蛋白的生物学活性进行检测是至关重要的。我们将含有诱导产生的IFN-λ 1的PBMC上清液，在乙肝病毒稳定转染细胞系 H印G2. 2. 15中进行抗病毒实验.与对照组实验相比，我们的方法诱导产生的IFN-λ 1能有效抑制乙肝病毒的DNA (图6)以及乙肝病毒抗原(图7)的水平。我们的方法诱导产生的IFN-λ 1，在人横纹肌肉瘤细胞系RD中能有效降低肠道病毒-71的拷贝数(图8)，在肝细胞系Huh7. 5. 1.中能有效抑制丙肝病毒的复制(图9)，在人胚胎肾上皮细胞系四3冊1( 中能有效抑制艾滋病毒的相对复制水平(图10)。因此我们可以确定，该方法产生的干扰素具有天然IFN-λ 1的生物学活性。该方法尽管是在体外的条件下诱导产生IFN-λ 1，但我们采用的诱导剂是人源的IL-32，诱导表达的细胞体系采用的是从健康人体内分离出的原代细胞PBMC，产生的IFN-λ 1与人体内自然产生的蛋白来源相同，这样不仅保证了其生物学活性的完整性，而且避免在临床应用中出现毒副作用。至此，我们确定该方法可有效、迅速、高效地诱导IFN-λ 1基因产物的产生。我们确定了该方法产生的IFN-λ 1具有很强的生物学活性，可有效抑制多种病毒的复制和表达。IL-32刺激PBMC表达产生IFN- λ 1的独特的分子生物学机制使该方法诱导IFN-λ 1的特异性更高，即该方法获得的产物相对现有的方法更为纯净。以此我们首次公开这一诱导IFN-λ 1产生的新方法。IFN-λ 1作为新的一类干扰素，对其表达调控、结构、生物学功能等方面的研究突飞猛进，对其生物学功能的描述日渐清晰，抗病毒和免疫调节方面的功效已经得到证实，临床应用前景广阔。本发明作为一种新的诱导IFN-λ 1的方法，应用前景有(1)将人源重组IL-32作为药剂，在体内诱导PBMC表达IFN-λ1，从而达到代替 IFN- λ 1的药物效果；
(2)用该方法体外诱导制备高效的IFN-λ1，经提纯后生产IFN-λ 1的蛋白药剂；
(3)用人源重组IL-32作为诱导剂刺激，在体外刺激PBMC或含有PBMC的全血，再将富含IFN-λ 1的细胞培养上清、血清、活细胞作为治疗药物；
(4)体外用IL-32γ诱导PBMC或PBMC的衍生细胞系，从而产生IFN- λ 1作为药物。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
(1)本发明采用血液制品的废弃物中提取的PBMC，原料变废为宝，使血液利用率达到最大，体现了环保理念，契合科学发展观。(2)本发明利用人源重组IL-32诱导产生IFN-λ 1的特异性高，产物与其他诱导剂 (如LPS等)相比更为较纯净(图3、4、5)。(3)本发明采用健康人的PBMC原代细胞诱导产生的IFN-λ 1蛋白分子，与人体内自然产生的IFN-λ 1完全相同，不仅保证了其完整的生物学功能，而且避免了因引入异源性的成分而导致产生毒副作用。


图1从健康人血液中分离出的外周血单核细胞(PBMC)在体外培养时的显微照片，左图为物镜10倍放大图，右图为物镜40倍放大图2原核表达纯化的白介素-32 γ的纯度检测，左边为PAGE电泳考马斯亮蓝染色，右边为 Western Blot ；
图3白介素-32对干扰素-λ 1、干扰素-β启动子的诱导效果； 图4不同浓度人源重组白介素-32处理M小时的PBMC中干扰素-λ 1、干扰素-α、干扰素-β的mRNA水平检测结果；
图5不同浓度人源重组白介素-32处理M小时后，PBMC分泌到细胞培养基上清中的干扰素-λ 1蛋白分子含量测定；
图6PBMC诱导分泌的干扰素-λ 1对乙肝病毒DNA的抑制活性检测； 图7PBMC诱导分泌的干扰素-λ 1对乙肝病毒s和e抗原的抑制活性检测； 图8PBMC诱导分泌的干扰素-λ 1对肠道病毒-71拷贝数的抑制活性检测； 图9PBMC诱导分泌的干扰素- λ 1对丙肝病毒拷贝数的抑制活性检测； 图10PBMC诱导分泌的干扰素- λ 1对艾滋病毒相对复制水平的抑制活性检测。 图11本方法技术路线图。

一.健康人血液处理品的获得以及PBMC的分离和培养1.从血站购买到血液利用后的处理物，其中包含了红细胞，全部白细胞，血小板和少量的血浆。2.在15ml离心管中加入7_8ml淋巴细胞分离液(购自TBD科学公司，中国)；
3.血液制品处理物和RPMI1640等体积混勻，用滴管沿离心管管壁将7ml上述混合液缓慢叠加淋巴细胞分离液液面上，注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm，20分钟。4.离心后管内分为三层，上层为皿浆和RPMI1640，下层主要为红细胞和粒细胞。 中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以PBMC的白色云雾层狭窄带。5.用小移液管吸取云雾层单个核细胞。置入另一短中管中，加入5倍以上体积 RPMI1640，水平离心1500rpm，10分钟，洗涤细胞两次。经过洗涤纯化后，如图1所示，在光学显微镜下视野中除PBMC细胞外，几乎看不到杂质颗粒，即得到纯净的PBMC。6.末次离心后，弃上清，加入RPMI1640，重悬细胞，用血球计数器计算单位体积的 PBMC细胞个数。7.取IO7个细胞于一个IOcm的细胞培养皿中，并补充RPMI1640培养基至总体积为10ml，于37°C，含5% (体积比)的(X)2细胞培养箱中培养。
二、原核表达载体的构建和人源重组IL-32的原核表达和纯化
1.设计特异性引物将IL-32编码序列构建到原核表达载体pet-Wa中。构建引物序列分别为上游引物 5，-CAGCGAATTCAATGTGCTTCCCGAAGG-3，(SEQ ID NO :1)下游引物 5’-GTCGAAGCTTTCATTTTGAGGATTGGG-3，(SEQ ID NO :2)。2.将构建好的原核表达载体质粒转化进大肠杆菌BL21，(中国典型培养物保藏中心)中并进行PCR和酶切鉴定。克隆构建和转化的具体方法和步骤见《分子克隆实验室手册〉〉(New York Co Id Spring Harbor laboratory Press，2002)。3.将转化好的大肠杆菌进行大量扩增，当菌液浓度达到吸光值(OD)为2时，加入 IPTG (SIGMA公司，美国)，使其终浓度为160ug/ml (质量体积比).37°C诱导4小时。4.将所有菌液8000rpm离心，收集细菌，加200ml PBS振荡重悬，超声破碎细菌。5.将细菌裂解液过M柱纯化，得到粗提纯的IL-32蛋白。具体方法步骤见商用 Ni柱(Qiagen Germany)使用说明书。6.利用去类毒素试剂盒除去所得的蛋白里混有的内毒素。具体方法步骤见商用去内毒素试剂盒(Genmed Scientific Inc. USA)使用说明书。7.利用规格为50kD的超滤管，去除大分子量的杂质蛋白，用规格为IOkD的超滤管去除小分子杂质。具体方法步骤见商用超滤管(Millipore. USA)使用说明书。8.将得到的蛋白经PAGE电泳和Wfertern Blot检测表达蛋白的正确性和纯度。 PAGE*flfertern Blot具体方法和步骤见《分子克隆实验室手册》(New York =Cold Spring Harbor laboratory Press,2002)
三、诱导特异性检测
1.终浓度分别为为l、5、10ng/ml (质量体积比)人源重组IL-32，刺激PBMC细胞M小时后，收集PBMC细胞。2.提取细胞总mRNA，方法和步骤如下 1) Iml Trizol试剂溶解一个皿的PBMC ；2)按每ImlTrizol试剂加入0. 2ml氯仿，剧烈振荡混勻10s，静置lOmin，4 °C条件下， 12，000rpm，离心 15min ；
3)将上清转移到新的1.5mL离心管中，再加入等体积的异丙醇，上下颠倒混勻，静置 15min, 12000rpm, 4 0C 条件下，离心 15min ；
4)移去异丙醇，用100%的乙醇洗涤沉淀一次，再加入75%(体积比)的乙醇Iml洗盐， 4 0C 条件下，7500rpm,离心 IOmin ；
5)除去75%(体积比)的乙醇，空气干燥5min ；
6)加入适量的DEPC处理的无菌水，溶解RNA。3.逆转录PCR得到cDNA。取上述处理的细胞总RNA各lPg，依次加入引物Oligo dT μ , MMLV 酶 μ ，RNase 抑制剂 μ ，MMLV 酶 10XRT-PCR 反应缓冲液 μ ，dNTP μ , 用DEPC处理水定容至20μ1，混勻。反应条件42 0C, 1 h，72 0C, lOmin，终止反应。4.将逆转录产物使用针对IFN-λ 1、IFN-α、IFN-β和β -actin的特异性引物进行荧光定量PCR。 IFN- λ 1引物序列为上游引物，GAGACCTCAAATATGTGG (SEQ ID NO :3)下游引物，GCATAAATAAGGTGTGGG (SEQ ID NO :4)。IFN-α 引物序列为上游引物， TTTCTCCTGCCTGAAGGACAGC SEQ ID NO :5)，下游引物，GCTCATGATTTCTGCTCTGACA(SEQ ID NO: 6)。IFN-β 引物序列为上游引物 TGGGAGGCTTGAATACTGCCTCAA (SEQ ID NO 7)
下游引物，TCCTTGGCCTTCAGGTAATGCAGA (SEQ ID NO :8)。β-actin 引物序列为上游引物 GCACCACACCTTCTACAATGAG (SEQ ID NO :9)下游引物，ACAGCCTGGATGGCTACGT (SEQ ID NO :10)。反应体系sybe green Mix ΙΟμΙ, H2O 8μ1,逆转录产物 μ ，引物 μ 。反应条件如下95°C 5min，l 个循环；95°C 15s，55°C 15s，72°C 15s，40 个循环；95°C持续降温至40°C。5.使用Roch software软件进行结果分析，根据Ct值得到相对的mRNA拷贝数， 其中β-actin作为内参。四、IFN- λ 1的诱导表达和表达量的检测
1.经细胞计数器计数后的IO7个PBMC细胞于IOcm的细胞培养皿中培养4小时，吸弃培养基，加入IOml新鲜的RPMI1640培养基培养。2.加入表达纯化的人源重组IL-32，使其终浓度为5ng/ml (质量体积比)， IFN-λ 1即开始被诱导表达，并开始分泌到细胞外。Μ小时后，收集PBMC细胞培养基上清。3.酶联免疫反应(ELISA)的方法进行检测，或采用人IFN-λ 1检测试剂盒进行检测。ELISA法检测IFN-λ 1蛋白表达量方法如下
1) PBMC细胞培养上清或者细胞裂解液样品按1 :50(体积比)用PBS (PH 7. 4)稀释， 取100μ1加入到ELISA板小孔中，37°C包被一小时或者4°C包被过夜。2)用PBS洗ELISA板5次(每次洗过尽量把液体拍干净，以保证尽量洗干净)。3)配3% (质量体积比)脱脂奶粉，用PBST溶解，按每孔100μ1加入到ELISA板上， 37°C封闭一小时或者4°C封闭过夜。4)用PBST洗5次以上。5) IFN-λ 1抗体(R & D公司，美国)用PBST按1 :500 (体积比)稀释，每孔加 100μ1，37 —小时。
6)用PBST洗5次以上。7)辣根过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG用PBST按1 :5000稀释，37°C半小时。8)用PBST洗5次以上。9)加酶结合物，每孔一滴，37°C半小时 10)用PBST洗5次。11)每孔分别加入显色液A和B (Milipore公司提供的显色试剂盒)，各一滴，37°C 避光显色5分钟。12)每孔加终止液(2mol/L mol体积比)一滴，酶标仪读数。
五、诱导产生的IFN-λ 1的生物学活性检测 IFN-λ 1活性检测方法和步骤如下
l、5ng/ml的人源重组IL-32 γ处理PBMC细胞M小时后，收集细胞培养基上清，未处理的PBMC细胞上清也收集起来作为对照。2、将H印G2. 2. 15细胞培养基上清吸干，加入以上收集的上清，培养M小时和48 小时，后分别收集细胞和上清。细胞用于提取乙肝病毒DNA，并用Taqman法检测乙肝病毒 DNA含量。上清用乙型肝炎s和e抗原检测试剂盒，检测两种抗原的表达量，与对照组比较， 从而得出诱导的IFN-λ 1抗乙肝病毒的活性。3、将人横纹肌肉瘤细胞系RD细胞，用肠道病毒-71感染4小时后，加入步骤1收集的细胞培养基上清，12小时后收集上清，检测肠道病毒-71的RNA拷贝数，与对照组相比， 分析出诱导的IFN-λ 1抗肠道病毒-71的活性。4、用丙肝病毒感染人肝癌细胞系Huh7. 5. 1,24小时后吸干培养基，加入步骤1收集的细胞培养基上清，并培养M小时，收集上清，用丙肝病毒拷贝数检测试剂盒检测其中的丙肝病毒的拷贝数，与对照相比分析诱导的IFN-λ 1抗丙肝病毒的活性。5、在人胚胎肾上皮细胞系中转染含有重组艾滋病毒基因组和报告基因的质粒，12 小时后，去上清，加入步骤1收集的培养基上清，培养M小时后，检测细胞里的荧光素酶活性活性，并与对照组比较分析分析诱导的IFN-λ 1抗艾滋病毒的活性。经以上实施例的方法和步骤后，能得到说明书附图1-10的效果，说明利用该方法快速获得了大量具有生物学活性的IFN-λ 1。


本发明公开了一种诱导产生Ⅲ型干扰素-λ1的方法。用合适浓度的原核表达纯化的人白介素-32作为诱导剂，在以人外周血单个核细胞或其衍生的细胞系的细胞模型中，诱导表达干扰素-λ1。刺激适当的时间后，该细胞的培养体系中会快速地、特异性地表达产生大量的具有生物学活性的干扰素-λ1。所产生的天然干扰素具有广谱抗病毒活性。