专利名称：生物诱导型活性人工角膜及其制备方法角膜病是目前眼致盲的主要因素，全球患者约有1000万人，我国也有约300万角膜盲患者。但由于供体来源的匮乏，我国每年能进行的同种异体角膜移植术仅约为1000例，大量的患者因人体角膜的短缺得不到医治，这是一个全球性长期未能解决的问题。由于眼免疫赦免现象和角膜的无血管特性，角膜移植术是全身组织器官移植中成功率最高的手术，因此，人工角膜及其移植优于其他组织工程器官和组织的移植。目前已有的人工角膜有非活性人工角膜及无生物诱导性的组织工程人工角膜两种，非活性人工角膜利用合成材料如甲基丙烯酸甲酯(MMA)等制作的人工角膜，在进行人体移植时，虽可使人视力有所恢复，但视野范围极小，人工合成材料难以和眼周围组织相融合，植入后有异物感，容易出现角膜溶解、房水渗漏、人工角膜脱出以及眼内炎等并发症，给患者带来很大的痛苦。而通常概念上的组织工程人工角膜是在体外强化的条件下，进行角膜细胞培养。体外培养的细胞在支架材料上生长后，才使之具有生物活性；这种方法制作出的人工角膜虽然在与眼周围组织相容性方面可能会有所改善，但由于它需要体外培养多种角膜细胞，而目前角膜细胞的获得和培养的途径和方法比较困难和不成熟，角膜细胞培养后的保存和传代繁殖也存在问题，整个过程较复杂、费用高，异体角膜细胞在移植过程中的免疫排斥作用亦是面临的一大难题。
本发明的另一目的在于提供一种制备上述生物诱导型活性人工角膜的方法。本发明的目的通过下述技术方案实现本生物诱导型活性人工角膜包括如下组分——壳聚糖 0.5％～3％胶原0.5％～3％透明质酸0.1％～0.5％水 93.5％～96.0％以上比例为重量百分比。除上述组份外，为助于刺激自体生长因子富集的速度，本生物诱导型活性人工角膜还可整合有角膜细胞生长因子如成纤细生长因子(FGF)，表皮细胞生长因子(EGF)和细胞转化生长因子(TGF-β1)，用量为3～100ng/ml，以0.01％～0.2％的碳二亚胺(EDC)交联剂交联，形成带生长因子的生物诱导型活性人工角膜。制备上述生物诱导型活性人工角膜的方法包括如下步骤(1)将壳聚糖溶于酸溶液，胶原和透明质酸溶于水；(2)混合各组分；(3)将混合液注入模具中并烘干；(4)用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其达吸水平衡。在步骤2的各组分混合均匀后可加入角膜细胞生长因子。所述酸溶液为盐酸溶液或醋酸溶液。
所述混合过程为在室温下搅拌1～2hr，使各组份充分混合均匀。
本发明的作用原理是人角膜组织主要由上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和胶原纤维及粘多糖构成，胶原蛋白占角膜干重的75％，可从动物中大量提取，来源丰富且价格不贵，因此采用胶原作为本人工角膜支架的基质材料。
从动物中提取的胶原，虽然在组成上与人体胶原相似，但在提取过程中其整体结构发生了变化，提纯后的胶原失去了强度，作为支架基质材料，在体内受胶原酶的作用，极易降解；为了弥补胶原的这些弱点，增强胶原的强度和控制其在体内的降解率，采取加入壳聚糖的方法；壳聚糖是一种天然的生物氨基多糖，与角膜细胞间质中的粘多糖有相似的结构，成膜性好、强度高、外观透明，在机体内不被胶原酶降解，可缓慢地被溶菌酶降解，从而可以调节支架基质材料的降解率，同时也可使用交联剂对材料进行交联，控制降解率。
透明质酸属粘多糖，它是构成角膜细胞外和细胞间基质的主要成分，具有粘弹性和大分子水合性，可促进和引导角膜细胞的生长繁殖，与胶原相结合形成的网状结构对角膜形态和正常生理状态的维持具有重要作用，通过与角膜内皮的结合，形成角膜组织表面的保护膜，控制体内自由基对角膜细胞造成的损伤，透明质酸分子中大量带负电荷的羧基与眼表面的粘多糖成份中含有的羟基通过氢键结合，易于与眼表面亲合。
生长因子对角膜细胞的培养、生长繁殖及与细胞外和细胞间基质的结合有极大的影响，不同角膜细胞生长因子之间的协同效应和用量对角膜细胞的生长繁殖可进行调控，其中成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子(TGF-β1)，和表皮生长因子(EGF)对角膜细胞的生长繁殖、细胞间的正常融合及与基质的结合均有促进作用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点(1)本发明生物诱导型活性人工角膜与眼组织具有优良的相容性，与眼角膜细胞相融合，诱导多种角膜细胞生长因子富集，刺激角膜细胞在其上生长繁殖；在角膜移植和修复前，不需进行体外角膜细胞的培养，因而免除了体外培养角膜细胞的复杂过程和由异体角膜细胞移植引起的免疫排斥反应，以及由此而产生的各种并发症，所以使用不但简单方便，而且非常安全可靠，作用效果较好；(2)本生物诱导型活性人工角膜具有与人眼角膜相似的光学与力学特性，可根据有关要求进行各种加工成型；已制作的生物诱导型活性人工角膜的光学力学指标与人角膜相似，如下所示材料透光率90～96％；材料折射率1.368～1.382(人眼角膜为1.377)；材料机械强度与人眼角膜相仿，其中湿态抗张强度4Mpa～8.6MPa；含水率55～75％；扯断伸长率300％～350％；(3)本生物诱导型活性人工角膜比较适合成型加工，制作过程简单、加工容易方便，所以可以大批量地制备及使用；(4)本生物诱导型活性人工角膜易于长期保存和长途输运，便于进行规模生产和实现产业化；(5)本生物诱导型活性人工角膜的发明，不但对于人民健康有重要促进作用，可产生重要社会与经济效益，而且还为其它生物诱导型活性人工组织的研究开辟了道路，因而具有重要的科学意义。
(四)

下面结合实施例对本发明作进一步具体的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1本生物诱导型活性人工角膜各组分的比例如下壳聚糖 2％胶原 2.5％透明质酸 0.3％水 95.1％以上比例为重量百分比。
用上述各组分制备本生物诱导型活性人工角膜的过程包括如下步骤(1)按上述用量称取各组分，将壳聚糖溶于盐酸溶液，将胶原和透明质酸溶于水；(2)将壳聚糖盐酸溶液与胶原和透明质酸的水溶液在室温下搅拌1.5小时，使各组份充分混合均匀；(3)在混合均匀的混合液中加入0.1％的碳二亚胺交联剂，90ng/ml成纤细生长因子，35ng/ml表皮细胞生长因子和60ng/ml细胞转化生长因子，再充分混合半小时；(4)将混合液注入预制的角膜模具中，注满角膜模具后将其放入烘箱内烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除残留杂质，并使其在水中放置24～48小时以达到吸水平衡，然后取出即制得本生物诱导型活性人工角膜。
实施例2本生物诱导型活性人工角膜各组分的比例如下壳聚糖 1％胶原 3％透明质酸 0.2％水 95.65％以上比例为重量百分比。
用上述各组分制备本生物诱导型活性人工角膜的过程包括如下步骤(1)按上述用量称取各组分，将壳聚糖溶于醋酸溶液，将胶原和透明质酸溶于水；(2)将壳聚糖醋酸溶液与胶原和透明质酸的水溶液在室温下搅拌2小时，使各组份充分混合均匀；(3)在混合均匀的混合液中加入0.15％的碳二亚胺交联剂，5ng/ml成纤细生长因子，20ng/ml表皮细胞生长因子和10ng/ml细胞转化生长因子，再充分混合半小时；(4)将混合液注入预制的角膜模具中，注满角膜模具后将其放入烘箱内烘干后取出；(5)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除残留杂质，并使其在水中放置24～48小时以达到吸水平衡，然后取出即制得本生物诱导型活性人工角膜。
实施例3本生物诱导型活性人工角膜各组分的比例如下壳聚糖0.5％胶原 1.5％透明质酸 0.3％水97.7％以上比例为重量百分比。
用上述各组分制备本生物诱导型活性人工角膜的过程包括如下步骤(1)按上述用量称取各组分，将壳聚糖溶于醋酸溶液，将胶原和透明质酸溶于水；(2)将壳聚糖醋酸溶液与胶原和透明质酸的水溶液在室温下搅拌2小时，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入预制的角膜模具中，注满角膜模具后将其放入烘箱内烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除残留杂质，并使其在水中放置24～48小时以达到吸水平衡，然后取出即制得本生物诱导型活性人工角膜。
实施例4本生物诱导型活性人工角膜各组分的比例如下壳聚糖 1.5％胶原2％透明质酸0.1％水 96.4％以上比例为重量百分比。
用上述各组分制备本生物诱导型活性人工角膜的过程包括如下步骤(1)按上述用量称取各组分，将壳聚糖溶于醋酸溶液，将胶原和透明质酸溶于水；(2)将壳聚糖醋酸溶液与胶原和透明质酸的水溶液在室温下搅拌2小时，使各组份充分混合均匀；(3)将混合液注入预制的角膜模具中，注满角膜模具后将其放入烘箱内烘干后取出；(4)用清水浸泡清洗烘干后所得的角膜制品以去除残留杂质，并使其在水中放置24～48小时以达到吸水平衡，然后取出即制得本生物诱导型活性人工角膜。
测量上述各实施例制得的生物诱导型活性人工角膜的光学力学指标与人眼角膜的参数比较如表一所示表一

由上表比较结果可知，本生物诱导型活性人工角膜在性能参数与人眼角膜值非常接近，由此可见，本生物诱导型活性人工角膜与人眼角膜较为相似。
将上述制得的生物诱导型活性人工角膜分别进行动物埋植实验、人工角膜板层移植实验。由实验结果可观察到植入后本人工角膜可一直保持透明，60天后取出染色后作病理切片在光学显微镜下观察，可见角膜结构正常，无炎症细胞，上皮无增厚及变薄，实质层无水肿，内皮结构正常；植入的生物诱导型人工角膜材料能与角膜相容，角膜与材料之间相粘结，在与角膜相粘连的材料处可见角膜细胞生长并具有向材料内部生长的趋势；材料两个月在体内的降解率约为30％。


本发明提供一种生物诱导型活性人工角膜,包括如下组分:壳聚糖0.5%～3%、胶原0.5～3%、透明质酸0.1%～0.5%、水93.5%～96.0%,以上比例为重量百分比;为助于刺激自体生长因子富集速度,也可先在材料上整合角膜生长因子;一种生物诱导型活性人工角膜的制备方法,包括如下步骤:将壳聚糖溶于酸溶液,胶原和透明质酸溶于水;混合各组分;将混合液注入模具中并烘干;用水浸泡清洗烘干后所得制品并使其达吸水平衡。本生物诱导型活性人工角膜具有与人眼角膜相似的特性,与眼组织的相容性好,适合成型加工,制作过程简单,并易于长期保存和长途运输,社会与经济效益较好,并具有重要的科学意义。