重组人干扰素用于预防严重性急性呼吸道综合征的新用途制作方法

候云德

2004年10月13日

2003年4月23日

2003年4月23日

北京金迪克生物技术研究所, 北京远策药业有限责任公司

A61K38/38GK1535724SQ0312222

干扰素 严重性 急性 预防 重组 用于

1.重组人I型干扰素用于预防由冠状病毒及其突变体引起的严重急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)其特征在于所用I型干扰素为重组人干扰素α1b、α2b和β干扰素2.根据权利要求1，预防由冠状病毒及其突变体引起的SARS的I型干扰素可以制成任何制剂形式，如喷雾剂、滴鼻剂、栓剂、口服剂、注射剂等，其特征在于无论采用何种剂型，其有效抗SARS病毒成份为I型干扰素

本发明涉及重组的细胞因子重组人干扰素用于预防严重性急性呼吸道综合征(recombinant human interferon，rhIFN)的新治疗适应症实验发现rhIFN可以明显地在体外抑制SARS病毒引起的细胞病变，这提示rhIFN可以作为用于预防SARS的新药根据干扰素(interferons，IFNs)的定义，干扰素是一类至少在同种细胞上有广谱抗病毒、抗细胞分裂、免疫调节活性和在不同途径上影响细胞的代谢、生长和分化的蛋白质，其活性的发挥需新合成RNA和蛋白质它是一类重要的细胞素经近30多年的临床研究和应用，说明它是一种重要的广谱抗病毒、抗肿瘤治疗药物迄今所知，人干扰素存在多个型别干扰素-α，β，δ，γ，ε，κ，λ，τ，和ω等型别，它们的主要特点和可能的临床应用见表1.表1 9种型别干扰素的主要特点和其临床应用或可能的临床用途一览表干扰素型别 主要特点 临床应用和可能的临床用途干扰素-α 属I型干扰素；约有23个 世界上批准用于治疗病毒病变种较详细研究的有约和恶性肿瘤的主要干扰素-α13种亚型分子量为有干扰素-α1b，α2b，α2a.，约19-26kDa，由156-166个 有40种治疗适应症氨基酸组成115-151之间为保守序列基因集中在9p22.受体位于21q22.1.干扰素-β 属I型干扰素；主要由成纤 美国FDA批准治疗多发性维细胞所产生，为糖蛋白， 硬化166个氨基酸Cys31/141之间的二硫键对其生物学活性的发挥是必需的在DNA水平上与干扰素α有30％的同源性干扰素α和干扰素-β结合于同一干扰素受体干扰素-γ 属II型干扰素；由T细胞 FDA批准治疗慢性淋巴肉芽和NK细胞刺激所产生肿；我国FDA批准治疗类风二聚体蛋白质有2处糖 湿性关节炎基位点143个氨基酸，无二硫键对酸不稳定与干扰素α和β无明显的同源性基因在12q24.1.受体为于6和21对染色体干扰素-ω 属I型干扰素；是人白细 1型丙型肝炎？胞干扰素的自然成分又称为干扰素-αII1与干扰素-α的其它成员高度同源，与之相关的是牛滋养层蛋白质TP-1干扰素ω结合于与干扰素-α和β同样的细胞受体干扰素-τ TP-1属1型干扰素，172 可能成为潜在的抗肿瘤药个氨基酸与IFN-ω相关 物，而无一般干扰素的毒性反刍动物滋养层在植床 作用以前几天分泌多种形式 可以预防实验性变态反应性的IFN-τ在识别母体和 脑脊髓炎；还能预防实验性建立孕体上起有重要作 脑脊髓炎超级抗原的重新激用在周围血淋巴细胞 活中，抗HIV的能力比干扰素-α强35倍，在导源于单核细胞的巨噬细胞中比干扰素-α强100倍干扰素-δ 属I型干扰素，猪孕体的滋？养外胚叶与干扰素-γ共同表达，149个氨基酸干扰素-λ(1-3) 包括干扰素-λ-1，2和？3，也各称为IL-29，IL-28A和IL-28B基因位于第19对染色体其受体由2个亚单位组成CRF2-12(干扰素-λR1)和CRF2-4(IL-10R2)干扰素-λ-1，2和3均通过同一组受体系统进行信号传递干扰素-κ 属I型干扰素；207个氨基 皮肤是机体最外围的防御器酸，N端27个氨基酸是信 官，干扰素-κ的基因可在上号肽，与1型干扰素的其 皮角化细胞组成性表达，可它成员有约30％的同源 能与其功能密切相关性与肝素可密切结合在静止期的树突状细胞和单核细胞可表达干扰素-κmRNA与干扰素-α和干扰素-β一样使用同一受体人干扰素-ε属I型干扰素189个氨动脉硬化症？基酸，N端21个氨基酸为信号肽3个Cys，位于53，163和175其中有一个Cys是不参与形成二硫键的基因在9p21.2-21.3有2个N糖基化位点，74和83位在许多成人组织中组成性地表达目前，研究较多并用于临床治疗的有α，β，γ；其它型别干扰素是否有临床应用价值尚在研究之中迄今所知，人、小鼠、牛、马等哺乳动物的干扰素至少有α、β、γ等三个型别IFN-α和IFN-β称为I型干扰素；IFN-ω和IFN-τ等也属于I型；IFN-γ为II型干扰素曾有一种IFN-β2已定名为IL-6，不属于干扰素在历史上曾有白细胞干扰素，成纤维细胞干扰素，免疫干扰素等名称，现已不采用1986年美国FDA首先同时批准基因工程干扰素-α2a(Roche公司)和干扰素-α2b(Schering公司)投放市场；基因工程干扰素-β、γ也相继于1990年、1993年获准投放市场目前有60多个国家批准干扰素治疗约40多种疾病国内由中国预防医学科学院病毒学研究所、卫生部上海生物制品研究所、卫生部长春生物制品研究所和中国药品生物制品检定所等单位共同研制并开发的人α1b型、α2a型，α2b型，γ型基因工程干扰素已经我国药品监督管理局批准投放市场，它是我国经国家正式批准的第一批基因工程高技术药物，其中人基因工程干扰素-α1b系我国首创，与国外同类产品比较，具有副作用低的优点但是，国际上干扰素的许多适应症是使用干扰素α2b型获得的从2002年11月起在我国广东省流行一种“非典型性肺炎”，在短短数个月时间内，流行到全球，统称为严重性急性呼吸道综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，受到世界各国的关注其原始病原主要是人类冠状病毒的一个新变种因此，冠状病毒受到广大医务人员和病毒学家的重视SARS病毒的传播方式原来认为是由咳嗽和打涕引起的飞沫传播为主，但是，根据其流行规律，以及发现患者粪便中存在的病毒量高于血液，因此，可能与动物冠状病毒感染一样，除呼吸到外，还可粪-口传播，通过患者排泄物的污染，手的直接触等WHO估计SARS的死亡率约为4％，死亡病例常伴有其它病情，如糖尿病或心脏病，或机体的免疫功能下降约有90％的病例在感染后1周内恢复这与西尼罗河病毒感染类似目前尚无特效药物治疗，也无疫苗可以预防干扰素喷雾剂个体防护预防是目前首选可实现的方法，其科学根据如下1、SARS病毒属新型冠状病毒，是(+)链RNA病毒，许多(+)链RNA病毒成员对干扰素均十分敏感，如鼻病毒，本实验室曾在细胞培养上大量进行过干扰素治疗鼻病毒14型和39型的研究工作，证明了干扰素对这一(+)链RNA鼻病毒的敏感性2、在英国猫腹膜炎冠状病毒的网页上，曾建议用干扰素治疗和控制猫冠状病毒而猫冠状病毒的抗体可以在细胞培养上抑制SARS病毒的生长http//www.dr-addie.com/3、Pei et al.(2001)报道用鸡干扰素I型可以抑制和治疗鸡支气管炎冠状病毒及其引起的感染而鸡支气管炎冠状病毒的抗血清也可以在细胞培养上抑制SARS病毒的生长Pei et al.(2001)Chicken interferon type I inhibits infectious bronchitis virusreplication and associated respiratory illness.J Interferon Cytokine Res.21(12)1071-1077.4、病毒唑(Ribavirin)对新分离的冠状病毒效果有限其中CDC的MMWR指出病毒唑在体外试验中对新分离的冠状病毒无抑制作用Lancet关于香港大学找到冠状病毒的报道也指出病毒唑在相当部分重症病人中效果不佳5、Aurisicchio et al.(2000)报道嗜肝性2型干扰素可以保护鼠肝炎病毒(一种冠状病毒)的感染Aurisicchio et al.(2000)Liver-specific alpha 2 interferon gene expression resultsin protection from induced hepatitis.J Virol.74(10)4816-4823.6、在试管内和机体内干扰素可以抑制猪产毒性呼吸道综合征病毒(一种冠状病毒)感染Buddaert et al.(1998)In vivo and in vitro interferon(IFN)studies with the porcinereproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV).Adv Exp Med Biol.440461-467.7、分离到新冠状病毒的细胞系Vero E6(及FRhk-4)在产生干扰素方面有缺损的，所以易于分离并产生病变Emeny JM，Morgan MJ.(1979)Regulation of the interferon systemevidence thatVero cells have a genetic defect in interferon production.J Gen Virol43(1)247-252其它的对老年人，免疫水平下降者要进行免疫加强治疗(干扰素本身也有此作用)因为冠状病毒感染时会破坏机体的免疫系统免疫加强剂有多种，包括预防动物冠状毒感染时使用的维生素A，E，C等，胸腺素，白介素-2等本发明已经证明北京远策药业有限公司生产的重组人干扰素α2b以及其它类型的干扰素在细胞培养上可以抑制SARS病毒的繁殖本发明采用经典的干扰素活性测定方法，采用SARS病毒-RDa细胞(人横纹肌瘤细胞株)系统将生长在10％FCS的RPMI-1640培养基的RDa细胞按1×105/ml接种96孔细胞培养板，每孔体积100μl，过夜培养后加入100μl系列稀释的干扰素a2b(北京远策药业有限公司生产的重组人干扰素α2b)、a1b(北京金迪克生物技术研究所研制)、β(北京金迪克生物技术研究所研制)、ω(北京金迪克生物技术研究所研制)(各三个平行孔)，作用12小时后弃培养液，重新加入用含2％FCS的RPMI-1640培养基稀释的50×TCID50的SARS病毒150μl(中国疾控中心病毒病所分离何培养)，24小时后观察病变，待病毒对照完全病变后，目测记录抑制50％细胞病变(CPE)的干扰素的最小量，结果证实重组人干扰素a2b、a1b、β在RDa细胞培养上对SARS病毒(冠9株)有较为明显的抑制作用、重组人干扰素ω抑制作用较小(结果见说明书附