专利名称:用于从固定组织样品回收核酸或蛋白质的方法、组合物和试剂盒的制作方法在组织学、病理学和细胞生物学领域,固定(fixation)为一种化学方法,通过该方法保存生物样品以防腐烂。固定终止任何正在进行的生化反应,且也可增加待处理样品的机械强度或者稳定性。固定的目的是尽可能以接近生物材料的天然状态来保存该生物材料的样品。固定样品用于检验或者分析。浸没(immersion)为一种固定技术,其中将样品浸没于体积最少为待固定组织体积20倍的固定剂中。固定剂扩散经过组织以固定,因此必须考虑组织的大小和密度以及固定剂类型。使用较大样品表示固定剂需要较长时间来到达较深组织。固定剂可分类为交联或者沉淀固定剂。交联固定剂通过在组织中的蛋白质之间产生共价化学键来起作用。这将可溶性蛋白质锚定于细胞骨架,且向组织提供额外的刚性。沉淀或者变性固定剂通过降低蛋白质分子的溶解度且经常通过破坏疏水性相互作用来起作用,所述疏水性作用给予许多蛋白质三级结构。组织学上一种常用的固定剂为交联固定剂甲醛,其通常作为饱和水溶液以福尔马林为名出售。甲醛被认为主要与碱性氨基酸赖氨酸的残基相互作用。用于固定的另一种通用醛为戊二醛,其被认为以与甲醛类似的机理起作用。甲醛通过以下方法来保存或者固定组织或者细胞通过-CH2 -连接即亚甲基桥交联蛋白质或者核酸中的伯氨基。由于甲醛是高反应性的,因此样品或者培养基中过量的甲醛将妨碍任何涉及具有氨基的功能蛋白质(诸如酶或者抗体)、核酸探针、树脂或者任何其它功能试剂的样品加工或者分析,这是通过过量的甲醛与这些氨基交联以及随后使试剂失活来进行的。此外,由于交联可通过加热来逆转,因此培养基中任何过量的甲醛将最终再次形成交联,这阻止了有效的交联逆转。氧化固定剂可与各种蛋白质和其它生物分子的侧链反应,这使得形成稳定组织结构的交联。当制备样品以用于电子显微镜术时,通常使用四氧化锇作为第二固定剂。重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾也用于特定组织学制品。两种常用沉淀固定剂为乙醇和甲醇。也使用丙酮。乙酸为一种变性剂,其有时与其它沉淀固定剂组合使用。已知醇本身在固定过程中引起组织的收缩,而单独的乙酸与组织溶胀相关;将以上两者组合可导致组织形态更好地保存。其它固定剂包括苦味酸和氯化汞。固定生物样品的一个问题是样品中的核酸和蛋白质可能与一种或者多种固定剂进行不可逆地结合。即使核酸和蛋白质并未与一种或者多种固定剂进行不可逆地结合,但是从样品中除去过量固定剂对于核酸和蛋白质的可靠回收和分析来说可能是重要的。此夕卜,固定剂可妨碍分离的蛋白质或者核酸在下游生化分析诸如PCR中的使用。
本发明涉及从固定生物样品和物质中回收并分析靶标分子诸如核酸或者蛋白质的方法和可用于这种方法中的试剂盒。在一个实施方案中,本发明提供从保存于液体细胞防腐保存液(liquid cytologypreservative solution)中的生物样品提取祀标分子的方法。 在一个实施方案中,所述方法包括:A)使生物样品与包含清除剂(scavengingagent)的清除溶液(scavenger solution)接触,所述清除剂包含至少一个下式的末端肼基H-ΝΤ. 7.以及1 5B)在足以使核酸或者蛋白质从生物样品释放的条件下处理所述生物样品;和C)从分尚的溶液中回收祀标分子,其中所述祀标分子为核酸或者多肽。在一个实施方案中,所述清除剂选自a)式I的化合物 NH2 (R1)ln .NH2H(I)和NH ;b)式II的化合物
H
R1IR2-N—NH2)n (II),其中R1选自=C1-C12烷基K1-C12烯基;C3_C6环烷基;C3_C6环烯基;C6_C1(I芳基;和
C6-Cltl杂芳基;R2在每种情况下可相同或者不同,且选自
O
IlO-1-和S
(i)——C——,( ) O (iii)——C——;m为选自O和I的整数;且η为选自I和2的整数。在某些实施方案中,所述清除剂可通过本领域已知的方法来修饰以增加清除剂在水中的溶解度。例如,R1可任选取代有增加R1成分的亲水性的成分。在另外的实施方案中,所述清除剂为式I的化合物,其中m为I且R1选自(^-(12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基。在另外的实施方案中,所述清除剂为式II的化合物,其中η为2,R1选自C1-C12烷基、C1-C6烷基和C2-C4烷基;且R2为
本发明提供通过采用清除分子诸如含有肼和含有酰肼的化合物来改善核酸或者蛋白质从保存于液体细胞防腐保存液中的样品中回收的方法和物质。本发明也提供包含含有肼和含有酰肼的化合物的裂解溶液以及包含所述化合物的试剂盒。
用于从固定组织样品回收核酸或蛋白质的方法、组合物和试剂盒制作方法
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