专利名称:包含编码血管生成因子的核酸的重组缺损腺病毒治疗肺动脉高血压症的用途的制作方法图1根据Crouzet等人(PNAS,第94卷,第1414页,1997年)描述的方法,由pXL3208和pXL3215质粒开始获得经双重组生成的pXL3264质粒。pXL3264质粒含有E1和E3区缺失5型腺病毒基因组并且含有CMV-spFGF1-SV40表达盒。图2代表pXL3179载体。pXL3179质粒是从pXL2774质粒(WO97/10343)衍生的载体,其中在来自人巨细胞病毒(hCMV IE)的早期区的启动子和SV40病毒(GenBank SVCG)的晚期区的聚腺苷酸化信号的控制下导入人成纤维细胞干扰素的信号肽和FGF-1(成纤维细胞生长因子)的cDNA的融合物的编码基因(sp-FGF-1,Jouanneau等,1991 PNAS882893-2897)。图3代表pXL3636和pXL3637载体。这些载体的结构类似于pXL3208质粒,并且它们分别在sp-FGF-1的位置(pXL3208,图1)包含编码VEGF-B167(pXL3636)和VEGF-B186(pXL3637)的序列。材料与方法分子生物学的一般技术分子生物学中使用的常规方法,例如质粒DNA的制备提取,根据氯化铯梯度的质粒DNA离心分离,用琼脂糖或丙烯酰胺凝胶进行的电泳法,通过电洗脱完成的DNA片段纯化,用酚或酚-氯仿提取蛋白,用乙醇或异丙醇在盐介质中沉淀DNA,在大肠杆菌中转化等,都是本领域技术人员熟知的,并且在文献具有充分描述[Maniatis T等人,“分子克隆,实验室手册”,冷泉港实验室,冷泉港,纽约,1982;Ausubel F.M.等人(编著),“分子生物学的通用规程”,John Wiley &Sons,纽约,1987]。关于连接,根据DNA片段的大小,在琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中通过电泳分离这些DNA片段,用苯酚或苯酚/氯仿混合物提取,在乙醇中沉淀,然后在根据供应商推荐的噬菌体T4(Biolabs)的DNA连接酶存在下培养。根据供应商的说明书,用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段对凸出的5’端进行填平。在根据生产者建议使用的噬菌体T4(Biolabs)的DNA聚合酶存在下,破坏凸出的3’端。通过借助核酸酶S1进行的处理研究破坏凸出的5’端。根据Taylor等人[《核酸研究》(Nucleic acid Res.),13(1985)8749-8764]的研制的方法,使用Amersham提供的试剂盒,用合成的寡脱氧核苷酸在体外进行诱变。
根据生产者的说明书,使用“DNA热循环器”(Perkin Elmer Cetus),采用所述的PCR技术进行DNA片段的酶促扩增[聚合酶催化的链反应,Saiki R.K.等人《科学》,230(1985)1350-1354;Mullis K.B.和Faloona F.A.,酶方法(《Meth.Enzym.》),155(1987)335-350]。
采用Sanger等人研制的方法[美国国家科学院(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),74(1977)5463-5467],使用Amersham提供的试剂盒,确认核苷酸序列。
实施例1表达FGF-1蛋白的重组腺病毒的构建该实施例描述包含编码FGF-1蛋白的基因的腺病毒载体的构建,该基因以操作方式与CMV启动子连接。
编码人FGF-1的人cDNA包含490碱基对,并且编码也被称为ECGFβ(β-内皮细胞生长因子)154个氨基酸的多肽。通过翻译后成熟机理存在两种从ECGFβ衍生的天然多肽,涉及酸性FGF(酸性FGF15-154aa)和ECGFα(α-内皮细胞生长因子;21-154aa)或FGF-1。
在后面描述的腺病毒中存在的FGF-1形式(sp-FGF-1)事实上是Jouanneau等(P.N.A.S.(1991)882893-2897)描述的FGF-1(21-154aa)和人β干扰素的信号肽的融合蛋白。
sp-FGF-1的表达处于巨细胞病毒的增强子/启动子(CMV,-522至+72核苷酸)的控制下(Boshart等人,1985《细胞》,41521-530)。SV40病毒的聚腺苷酸化位点(根据SV40基因组的2538-2759核苷酸,Genbank locus SV4CG)在晚期方向上被插入sp-FGF-1的cDNA的3’位。通过①巨细胞病毒的增强子/启动子,②sp-FGF-1的cDNA,③SV40病毒的聚腺苷酸化位点生成的整体在下面被称作FGF-1表达盒。
根据Crouzet等人(PNAS,第94卷,第1414页,1997年)描述的方法,通过在pXL3208质粒与pXL3215质粒之间同源重组构建腺病毒。pXL3215质粒含有腺病毒基因组,而它含有在E1区插入的RSV-LacZ盒。在图1中描述了这种构建的原理。由这种双重组产生的pXL3264质粒含有缺失E1和E3区的5型腺病毒基因组,并且含有CMV-spFGF1-SV40表达盒。通过FGF-1表达盒的测序证实了这种构建。
用293细胞系(ATCC CRL-1573)中的PacI消化的pXL3264的DNA经转染产生了AV1.0CMV-FGF1腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此相同的细胞系由通过CsCl双梯度得到的病毒原种扩增。
这些病毒颗粒然后用于研究人spFGF1基因在C2C12细胞,小鼠成肌细胞(ATCC CRL-1772)或W162细胞中的表达(Weinberg D.H.和KetnerG.A.1983,PNAS805383-5386)。
感染至MOI增加为100-3000病毒颗粒(pv)/细胞或者在脂质转染胺试剂(Gibco-BRL)存在下用含有相同的FGF-1表达盒作为对照物的pXL3179质粒转染细胞之后对W162细胞进行RNA印迹。图2代表pXL3179质粒。
感染至MOI为100-3000之后对C2C12细胞进行蛋白质印迹,并且在48小时之后收集上清液。通过纯化的兔的抗-FGF1多克隆抗体随后通过与过氧化物酶缀合的山羊的抗兔抗体随后通过与过氧化物缀合的山羊的抗兔抗体揭示FGF1。然后通过化学发光物(ECL,Amersham)揭示过氧化物酶活性并且在Lumi-Imager(Roche diagnostics)上检测。
使用C2C12细胞培养上清液证实FGF表达形式是否是生物活性的。然后向NIH3T3细胞培养物加入该上清液的系列稀释液(1/200和1/50)。通过掺入放射性标记胸苷观察这些培养物的营养效果。
得到的全部结果证明AV1.0 CMV-FGF1腺病毒表达FGF-1的生物活性形式。
实施例2表达VEGF-B蛋白的重组腺病毒的构建该实施例描述包含编码VEGF-B蛋白的基因的腺病毒载体的构建,该基因以操作方式与CMV启动子连接。
存在两种人VEGF-B形式VEGF-B167和VEGF-B186,它们的相应核苷酸序列可以GenBank中编号HSU48801(VEGF-B167)和HSU43368(VEGF-B186)获得。
与用AV1.0-CMV-spFGF-1载体类似的方法,从载体pXL3636和pXL3637开始构建AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186(图3)。VEGF-B167或VEGF-B186的表达处于巨细胞病毒的增强子/启动子(CMV,-522至+72核苷酸)的控制下(Boshart等人,1985《细胞》Cell,41521-530)。SV40病毒的聚腺苷酸化位点(根据SV40基因组的2538-2759核苷酸,Genbank locus SV4CG)在晚期方向上被插入VEGF-B167或VEGF-B186的cDNA的3’位。
根据Crouzet等人(PNAS,第94卷,第1414页,1997年)描述的方法,通过在pXL3636质粒(VEGF-B167)和pXL3215质粒或pXL3637质粒(VEFG-B186)与pXL3215质粒之间同源重组构建了腺病毒。pXL3215质粒含有腺病毒基因组,而它含有在E1区中插入的RSV-LacZ盒。在图1中描述了这种构建的原理。
由这种双重组产生的质粒含有缺失E1和E3区的5型腺病毒基因组,并且或者含有CMV-VEGF-B167-SV40表达盒或者含有CMV-VEGF-B186-SV40表达盒。
通过采用在293细胞系(ATCC CRL-1573)中被PacI消化的双重组产生的质粒的转染产生了AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186腺病毒。得到的病毒颗粒然后在此相同细胞系中由通过CsCl双梯度得到的病毒原种扩增。
实施例3大鼠身上AV1.0CMV-FGF1的肺内转移该实施例描述了用上述AV1.0CMV-FGF1载体将编码人FGF-1的基因转移到大鼠体内。相同但不包含FGF-1表达盒的重组腺病毒(AV1.0CMV.Null)用作对照动物。
将一月龄(200-250克)的雄性Wistars大鼠随机分为两组。通过腹膜内注射氯胺酮(100毫克/千克)和甲苯噻嗪(2毫克/千克)的混合物将其麻醉之后,以108pfu的剂量(用PBS稀释,最终体积是150微升)气管内滴注AV1.0CMV-FGF1载体或者AV1.0CMV.Null对照载体。研究剂量-反应关系之后选择该剂量,包括支气管肺泡洗涤液中和动物血清中蛋白质FGF-1的ELISA剂量。给予病毒之后48小时,在正常气压条件下(F1ufrance橱,Cachan,法国)将大鼠暴露于低氧气体混合物(Fio2 10%)中15天。
实施例4大鼠体内AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186的肺内转移在和实施例3描述相同的条件下进行大鼠体内AV1.0-CMV-VEGF-B167和AV1.0-CMV-VEGF-B186的肺内转移。不包含VEGF-B表达盒的重组腺病毒(AV1.0CMV.Null)被用于对照动物体内。
实施例5大鼠体内编码人VEGF-B的基因的肺内转移效率的评价根据上述标准在低氧暴露15天之后进行评价。
a-采用支气管肺泡洗涤液中FGF-1蛋白的剂量(ELISA)评价翻译效率。
b-通过麻醉下心导管插入术血液动力学研究评价HTAP,并且测量肺动脉血压,全身动脉血压和心率。
c-通过计算Fulton指数评价右心室肥厚右心室重量/左心室重量+中隔。
d-研究肺组织学和组织形态学,并且评价肺动脉和肺泡和肺泡管肌化程度(直径<200微米)。
2a-转导效率在低氧下暴露15天之后在动物支气管肺泡液(LBA)血清中进行人VEGF-B蛋白质ELISA测量。无论在何种应用条件下(存在或不存在低氧)对照动物的血清中均不存在VEGF-B因子。同样地,在由编码VEGF-B(167型或186型)的缺损重组腺病毒载体治疗的动物的LBA中VEGF-B的浓度为零。
2b-HTAP的评价通过麻醉下心导管插入术对血液动力学研究来评价HTAP,并且测量肺动脉血压,全身动脉血压和心率。
从暴露于低氧开始15天之后两组大鼠体重相同。用AV1.0-CMV-VEGF-B167或AV1.0-CMV-VEGF-B186治疗的大鼠具有与接受AdCMV.Null的大鼠相比明显地较低的肺动脉血压,而两组(处理组和对照组)之间全身动脉血压和心率没有明显不同。
这些结果证明,转移编码VEGF-B的基因非常有效地预防与低氧下相关联的动脉血压升高。
2c-右心室肥厚的评价通过右心室重量与左心室重量+中隔之比来评价右心室肥厚。
得到的结果证明,在接受AV1.0CMV.Null的大鼠体内,右心室肥厚与采用AV1.0-CMV-VEGF-B167或AV1.0-CMV-VEGF-B186治疗的大鼠相比明显地更为严重。
2d-肺的组织学研究肺的组织学研究证明,108pfu剂量下炎症病变非常有限不存在水肿和出血,不存在支气管或肺泡上皮损伤。经常可以观察到,无论以何种方式给药治疗都不存在巨噬细胞显性间质性肉芽肿。
根据下述两个标准对肺的组织形态学进行研究,(i)动脉长度规格化的动脉壁厚度的研究(动脉管直径<200微米),(ii)肺泡和肺泡管未被肌化、部分肌化或完全肌化的动脉的百分比的研究。
测定动脉壁厚度,得到的结果证明,在接受AV1.0CMV.VEGF-B载体的大鼠体内动脉长度规格化的动脉壁厚度与通过AV1.0CMV.Null治疗的大鼠相比明显地更薄。
测定肺泡和肺泡管未被肌化、部分肌化或完全肌化的动脉的百分比,并且得到的结果证明,在采用编码VEGF-B的缺损型重组腺病毒载体治疗的大鼠体内,肺泡和肺泡管中未被肌化的动脉的百分比均明显地更高。
这些结果清楚地证明,内皮细胞生长因子例如VEGF-B在肺中超表达具有预防低血氧HTAP发展的作用。
实施例6大鼠体内人FGF-1基因的肺内转移效率的评价根据上述标准在低氧暴露15天之后进行评价。
a-通过测定支气管肺泡洗涤液中FGF-1蛋白的剂量(ELISA),评价转导效率。
b-通过麻醉下心导管插入术进行血液动力学研究评价HTAP,并且测量肺动脉血压,全身动脉血压和心率。
c-通过计算Fulton指数评价右心室肥厚右心室重量/左心室重量+中隔。
d-研究肺组织学和组织形态学,并且评价肺动脉中肺泡和肺泡管的肌化程度(直径<200微米)。
所得结果证明,内皮细胞生长因子例如FGF-1在肺中超表达具有有效预防低血氧HTAP发展的作用。
本发明涉及包含编码血管生成因子的核酸的载体在预防、缓解和/或治疗肺动脉高血压症方面的用途。
包含编码血管生成因子的核酸的重组缺损腺病毒治疗肺动脉高血压症的用途制作方法
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