专利名称：供体角膜hbv和tp的荧光定量pcr检测试剂盒及检测方法我国眼库的生物安全性极差，没有控制供体角膜的医源性感染问题。因为眼库供 体的全身情况的资料不全，意外死亡的捐赠者甚至没有全身情况的医学资料，存有传染各 种病原体的很大风险，所以在供体角膜十分奇缺的情况下，要在保障安全的前提下，尽可能 发挥供体角膜的临床使用范围。目前我国眼库的主要问题是如何建立一套利用的结膜组织 快速、准确筛查供体角膜感染病原体的方法。供体角膜的实验室检测方法目前主要包括血清免疫学方法和基因检测法。血清免 疫学方法可由检验科完成，该方法价格便宜，操作简单，但是灵敏度低，容易出现假阴性，可 作为一种初筛手段。并且该方法在无法获得供体血样的情况下无法实行；基因检测可分为 定性检测和定量检测，目前的研究发展趋势是迅速发展能够快速、定量检测并且成本较低、 易于推广的新技术。聚合酶链反应技术虽已被广泛用于核酸分析，但普通PCR的假阳性污 染和定量准确度一直困扰着人们。它依赖于各种不同类型PCR的后处理过程，而这些处理 过程很易使数量巨大的PCR产物飞散到空气中，使PCR的假阳性污染成为大规模临床应用 的最大问题。另一方面，所有这些方法的定量都是针对PCR终产物来进行的，而PCR的平台 效应大大干扰了 PCR的原始模板数量和终产物之间的相关性，使定量准确度难以提高。
本发明的目的是提供供体角膜重大致病病原体HBV、TP的快速检测试剂盒及检测 方法，以弥补现有技术的不足。^ % 1%, FQ-PCR(Real Time Fluorescent Quantity Polymerase Chain Reaction)方法采用完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；同时采用实时检测 技术，所得Ct值和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确率极高。本发明所采用的技术路线是本发明针对供体角膜组织的重大致病病原体HBV、 TP的核苷酸序列，设计合成相应的正向和反向引物、荧光探针和阳性工作标准品。将梯度稀 释的阳性工作标准品分别作为模板进行FQ-PCR反应，分别得到各自的Ct值，通过Ct值与 起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系制作出相应的标准曲线。HBV和TP的遗传物质 为DNA，提取供体眼球结膜组织的DNA后直接作为模板结合各自的荧光探针的扩增检测技 术，通过荧光信号的数值检测病原体DNA的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致 病病原体HBV或TP及其数量。本发明的具体技术方案如下本发明的快速检测试剂盒由DNA提取试剂、DNA扩增试剂和阳性工作标准品组成。 其中DNA提取试剂为硅胶膜通用型DNA小提试剂盒；DNA扩增试剂包括2. 5XPCR预混试剂，20X荧光探针增强剂，正向及反向HBV引物，HBV荧光探针，正向及反向TP引物，TP荧光探 针，无核酸酶的蒸馏水，HBV阴性对照，HBV阳性对照，TP阴性对照，TP阳性对照；阳性工作 标准品分别为含有HBV正向和反向引物扩增的目的序列的pUC57-HBV质粒，含有TP正向和 反向引物扩增的目的序列的PUC57-TP质粒。其中，HBV和TP的引物、荧光探针与阳性工作标准品序列如下HBV 正向HBV 引物TCCTGGCTATCGCTGGATGT反向HBV 引物AGGCATAGCAGCAGGATGAAGHBV 荧光探针序列FAM+CTGCGGCGTTTTATCATATTCC+TAMRAHBV扩增片段长度为66bp。HBV阳性工作标准品的目的序列为Tggccaaaattcgcagtccccaacctccaatcactcaccaacctcttgtcctccaacttgtcctggcta tcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctcttcatcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctggactaccaaggtatg ttgcccgtttgtcctctacttccaggaacatcaactaccagcacgggaccatgcagaacctgcacgattcctgctcaHBV阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。TP 正向 TP 引物ATCCGGCATATGTCCAAGCT反向TP 引物TGTGAGCGTCTCATCATTCCATP 荧光探针序列FAM+TCATGCACCAGCTTCGACGTCT+TAMRATP扩增片段长度为65bpTP阳性工作标准品的目的序列为gtgtacatgtgcacgtagcactaatgtcgagactgaaaaggagtgcacagaacagcatggggtatctgc atctgctgtgcaggatccggcatatgtccaagctgtcatgcaccagcttcgacgtctttggaatgatgagacgctcacacttgttatgca taatggaaagtttgattatcacgttatgcatcgtgcaggcgtttttgagcactgtgcatgtaatattttcgatacgatggtTP阳性工作标准品的目的基因的片段长度为240bp。利用本发明的检测试剂盒对眼库供体HBV或TP的DNA进行检测的方法1.供体眼球结膜组织DNA的提取和阳性工作标准品的构建取供体眼球的结膜组 织块5mg，放入离心管中，应用德国QIAGEN公司出品的DNA提取试剂提取组织DNA作为DNA 模板，用于下面的扩增反应；2. HBV 或 TP DNA 的扩增在两组反应管中分别加入下列组分2. 5XPCR预混试剂(北京天根生化科技有限公司出品)8 y L正向HBV 或 TP 引物(5pmol/ u L) luL反向HBV 或 TP 引物(5pmol/ u L) luLHBV 或 TP 荧光探针(5pmol/ u L) 0. 5 u L20X荧光探针增强剂(北京天根生化科技有限公司出品)1 P LDNA 模板5pg_50ng无核酸酶的蒸馏水至20 ii L其中HBV组DNA模板为lCf-lO1拷贝/ P L倍比稀释的HBV阳性工作标准品和从供 体眼球的结膜组织提取的DNA ；TP组DNA模板为lCf-lO1拷贝/ y L倍比稀释的TP阳性工作 标准品和从供体眼球的结膜组织提取的DNA，每个模板设立三个复孔，混勻离心后进行扩增 反应，具体程序如下 反应完成后得到HBV或TP阳性工作标准品的Ct值，通过Ct值与起始模板浓度的 对数值之间存在的线性关系分别制作出HBV或TP的标准曲线，评价标准曲线的优劣有两个 指标，相关系数r2和斜率，相关系数反应标准曲线的直线性，理想值应大于0. 98，越接近于 1说明直线性越好，定量越准确。斜率反应PCR扩增效率(E)，PCR理想的扩增效率应在0.8 <E< 1.2范围。PCR扩增效率可以通过标准曲线的斜率计算得出，当标准曲线X轴表示起 始模板浓度，Y轴表示Ct值时E = 10[_lM°pe]-l。当标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示时 起始模板浓度E = 10_sl°pe-l。当供体眼球的结膜组织的DNA与阳性工作标准品同时进行反应后，制作出标准曲 线，再将供体眼球的结膜组织的DNA扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可以得到供体 眼球的结膜组织的HBV或TPDNA的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体 HBV或TP及其数量。本发明通过定位HBV或TP病原体基因的保守序列，设计FQ-PCR的引物和荧光探 针，利用FQ-PCR技术快速灵敏检测HBV和TP ；本发明采用完全闭管检测，避免了交叉污染， 同时定量准确率极高(相对误差约为50%，足以适应临床核酸定量的要求)，且本发明可实 现对供体角膜的HBV和TP的检测，填补了临床上供体角膜HBV和TP检测的空白，改变了以 往只能从供体血液检测HBV和TP的现状；可应用于临床眼库供体少量结膜组织标本HBV和 TP的检测。20X荧光探针增强剂1 P L供体眼球的结膜组织提取的DNA模板1 y L无核酸酶的蒸馏水7. 5 ii L分别加入lCf-lO1拷贝/PL倍比稀释的HBV阳性工作标准品和供体眼球的结膜 组织提取的DNA作为模板，每个模板设立三个复孔。扩增条件95°Clmin ；95°C 15s，55°C 20s，68°C 40s，45 个循环。当供体眼球的结膜组织提取的DNA与阳性工作标准品同时进行反应后，设定阈值 和基线，可以得到各自的Ct值，通过Ct值与起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系， 制作出标准曲线，HBV标准品的扩增效率为1，线性相关系数为0. 999，是一条完全符合要求 的标准曲线。将供体眼球的结膜组织提取DNA的扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可 以得到供体眼球的结膜组织HBV的拷贝数，从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体 HBV及其数量。实施例2供体角膜TP检测1.供体眼球结膜组织DNA的提取和阳性工作标准品的构建具体步骤同实施例1 中供体眼球结膜组织DNA的提取。构建含有TP基因的质粒(pUC57-TP)作为阳性工作标准品。阳性工作标准品含有 TP正向和反向引物扩增的目的序列，另外还在目的序列的两侧各多加了一段序列，使其更 加接近实际检测样品的结构，以保证与实际检测样品间的扩增效率的一致性。应用 Promega PureYield plasmid miniprep system 试剂盒，提取 TP 阳性工作标 准品质粒，再应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，得到TP阳性工作标准品的纯度和浓度。按照拷贝数=(质量/分子量)X6.02X 1023拷贝/yL的公式，计算阳性工作标 准品的拷贝数。将TP阳性工作标准品进行10倍梯度稀释，选取TP阳性工作标准品lCf-lO1 拷贝/ P L的八个浓度作为阳性工作标准品应用于扩增。2. TPDNA 的扩增配制扩增反应体系2. 5XPCR 预混试剂8 ii L正向TP 引物(5pmol/ii L) luL反向TP 引物(5pmol/ii L) luLTP 荧光探针(5pmol/ u L) 0. 5 u L20X荧光探针增强剂1 P L供体眼球的结膜组织提取的DNA模板 1 y L无核酸酶的蒸馏水7. 5 ii L分别加入lCf-lO1拷贝/ P L倍比稀释的TP阳性工作标准品和供体眼球的结膜组 织提取的DNA作为模板，每个模板设立三个复孔。扩增条件95°C lmin ；95°C 15s，55°C 20s，68°C 40s，45 个循环。供体眼球的结膜组织提取的DNA与阳性工作标准品同时进行反应后，设定阈值和 基线，可以得到各自的ct值，通过ct值与起始模板浓度的对数值之间存在的线性关系，制 作出标准曲线，TP标准品的扩增效率为0. 97，线性相关系数为0. 999，是一条完全符合要求 的标准曲线。将供体眼球的结膜组织提取DNA的扩增曲线得到的Ct值代入标准曲线，就可 以得到供体眼球的结膜组织TP的拷贝数从而确定供体角膜组织内是否感染致病病原体TP 及其数量。引物和探针序列<110>山东省眼科研究所<120>供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法
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一种供体角膜HBV和TP的荧光定量PCR检测试剂盒及检测方法。试剂盒由DNA提取试剂、DNA扩增试剂和阳性工作标准品组成。其中DNA扩增试剂包括预混试剂，20X荧光探针增强剂，正、反向HBV引物，HBV荧光探针，正、反向TP引物，TP荧光探针，无核酸酶的蒸馏水，HBV和TP阴性对照与阳性对照；阳性工作标准品为含有HBV正、反向引物扩增的目的序列pUC57-HBV质粒，含有TP正、反向引物扩增的目的序列pUC57-TP质粒。本发明实现了对临床供体结膜组织标本的完全闭管检测，不需PCR后处理，避免了交叉污染；同时采用实时检测，所得Ct值和原始模板数量完全呈线性相关，定量准确率极高，相对误差约为50％，足以适应临床核酸定量的要求。