一种脱细胞角膜组织及其制备方法和应用的制作方法 [0002] 角膜位于眼球最表面，直接与外界接触，容易受到损伤（物理、化学）和感染，一旦 发生病变则会发生混浊而影响视力，甚至致盲。常见的角膜病变有角膜炎、角膜溃疡、圆锥 角膜、角膜软化症和角膜变性等。据世界卫生组织（WHO)统计，目前全世界有角膜病盲患者 近5000万人，我国有约400万人。角膜病严重影响了患者们的正常生活、工作与学习，生活 上需要家人和社会的照顾，增加了家庭的经济负担，也加重了全社会的负担。角膜移植是角 膜病盲患者恢复视力和复明的唯一希望，但由于我国角膜捐献数量极其有限，全国每年能 进行的角膜移植手术目前仅有3000余例，致使绝大多数患者因得不到可用的供体角膜而 无法重见光明。 [0003] 目前，国内外同类产品主要以羊膜、胶原及其他合成高分子材料用于角膜移植研 宄，但都存在不同的缺陷。羊膜相对较薄，仅适用于治疗眼表浅度损伤。合成材料的透明性 和稳定性较差，在降解过程中降解产物可引起局部PH值下降，术区出现非特异性无菌性炎 症反应率较高。胶原是组织工程常用的材料，但纯胶原韧性差，易碎，降解过快，手术后一段 时间内就发生碎裂，无法达到复明的效果，因此目前仍停留在基础研宄阶段。相比而言，异 种角膜基质材料来源丰富，具有与正常角膜基质相似的组织结构，移植之后角膜基质的厚 度、屈光度不变。天然的角膜基质层存在着某些生长因子，可促进细胞的生长、繁殖和分化， 而且免疫原性低，神经可以长入，有利于角膜知觉的恢复。此外，由于异种移植供体来源的 动物，如猪，在生理上与人类具有高度相似性，故其组织或器官被认为是理想的供体之一， 以猪作为异种移植供体来源的研宄比较深入，猪的组织器官（如心脏瓣膜、胰岛细胞、凝血 因子等）已用于人类疾病的治疗，异体脱细胞真皮基质已被批准用于临床。猪角膜基质含 有角膜细胞生长所必需的多种细胞外基质成分，具有良好的生物相容性，能够成为有效的 角膜基质替代物。 [0004] 异种移植供体来源的动物（如猪）的角膜基质组织中含有自身固有的细胞，需经 过脱细胞处理才能获得无免疫原性或免疫原性较低的角膜基质替代物。现有的角膜基质 替代物主要通过将动物源性角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、干燥和灭菌 处理获得，且酶消化一般采用含有胰酶的缓冲液进行处理。这样的方法对制备得到的角膜 基质替代物的胶原板层结构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，且透光率较 低，并不能完全满足临床移植的要求，而且无法长期湿态保存。 [0005] 因此，研发一种能够完全脱除异种移植供体来源的动物（如猪）角膜基质中的细 胞成分，对胶原板层结构破坏极小，使所得角膜基质的板层结构保留完整且胶原纤维排列 整齐、孔隙均匀规则、透光率较高且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿态保存的角膜 基质替代物的制备方法，具有重要的现实意义和广阔的应用前景。

[0006] 本发明的目的是为了克服现有方法对制备得到的角膜基质替代物的胶原板层结 构破坏较大，使得胶原纤维排列较凌乱，孔隙不均匀，透光率较低，并不能完全满足临床移 植要求且无法长期湿态保存的缺陷，提供一种胶原纤维排列整齐、孔隙均匀规则、板层结构 保留完整、透光率较高且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿态保存的脱细胞角膜组织 及其制备方法和应用。
[0007] 因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种脱细胞角膜组织的制备方 法，所述方法包括：将在无菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、 反复冻融、酶消化、超声、灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲 液进行处理。
[0008] 第二方面，本发明提供了所述方法制备得到的脱细胞角膜组织。
[0009] 第三方面，本发明还提供了所述脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应 用。
[0010] 本发明的脱细胞角膜组织，来源丰富，生物相容性及生物安全性好，胶原纤维排列 整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，且在角膜基质不变性的 前提下能够长期湿态保存；理化性能良好，角膜透光率为70% -80% ;机械强度高，能够耐 受手术缝线牵拉、韧性良好并能长期应用于临床，主要用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、 疤痕、化学或热烧伤等致盲性眼病，将病变处被损坏的角膜切除并将同样尺寸的板层角膜 基质支架植入患者眼中，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。
[0011] 本发明的方法具有以下特点：
[0012] 1)本发明方法的工艺流程简单可靠，周期短。
[0013] 2)本发明方法采用的原料来源广泛，成本低，使用方便。
[0014] 3)本发明的方法，最大程度地减少了对角膜基质胶原结构的破坏，胶原纤维排列 整齐，无细胞残留，前弹力层及基底膜都保留，便于上皮层的生长，提高了脱细胞角膜组织 的生物相容性。
[0015] 4)本发明方法制备得到的脱细胞角膜组织，在使用前用生理盐水或PBS缓冲液清 洗后即可使用而无需进行复水处理，使用方便，且在角膜基质不变性的前提下能够长期湿 态保存，可长达6个月。
[0016] 5)本发明方法制备得到的脱细胞角膜组织，通过自检、型式检验验证了该产品的 安全性，结果显示其机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植的要求。
[0017] 6)本发明方法制备得到的脱细胞角膜组织，适合用于基质层异常角膜的临床移 植，使众多角膜基质异常患者重见光明成为可能，为组织工程角膜产业提供了重要的技术 支持。
[0018] 本发明的其它特征和优点将在随后的




[0019] 图1是本发明实施例1制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。
[0020] 图2是正常人角膜板层结构的冰冻切片图。
[0021] 图3是本发明实施例5制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。
[0022] 图4是本发明实施例6制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。
[0023] 图5是本发明对比例1制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。
[0024] 图6是本发明对比例2制备得到的脱细胞角膜组织的冰冻切片图。

【具体实施方式】
[0025] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0026] 第一方面，本发明提供了一种脱细胞角膜组织的制备方法，所述方法包括：将在无 菌条件下切取的新鲜动物眼球的角膜基质片依次进行低渗溶胀、反复冻融、酶消化、超声、 灭菌和湿态封存处理，所述酶消化采用含有DNA酶和RNA酶的缓冲液进行处理。
[0027] 根据本发明的方法，本领域技术人员可以理解的是，在无菌条件下切取角膜基质 片前，一般先将新鲜动物眼球用酒精或含妥布霉素的PBS溶液浸泡。PBS缓冲液可以为 IXPBS缓冲液。
[0028] 对于酒精和妥布霉素的浓度以及浸泡时间没有特别的要求，可以为本领域常用的 浓度和浸泡时间。优选情况下，酒精的体积百分浓度为70-80%，进一步优选为75% ;妥布 霉素的浓度为30000-50000U/L，进一步优选为40000U/L ;浸泡时间为10-30s。
[0029] 对于切取的角膜基质片的直径和厚度没有特别的要求，可以为本领域常规的 角膜基质片的直径和厚度。优选情况下，切取的角膜基质片的直径为8-10mm，厚度为 200-600 μ m〇
[0030] 为了提高制得的脱细胞角膜组织和人角膜基质细胞的生物相容性，优选情况下， 动物为猪、牛或猴，进一步优选为猪。
[0031] 根据本发明的方法，低渗溶胀处理的方法可以包括：将切取的角膜基质片放在低 渗液中浸泡至溶胀。对于低渗液没有特别的要求，可以为本领域常用的各种低渗液，为了能 够更好地胀破细胞膜和核膜，优选情况下，低渗液为三蒸水。为了使角膜基质片在低渗液中 溶胀至合适的程度，优选情况下，浸泡的时间为8-12h。
[0032] 根据本发明的方法，为了最大程度地减少对角膜基质胶原结构的破坏，更好地骤 缩骤胀细胞膜和核膜，进而使细胞膜和核膜破损，优选情况下，反复冻融的条件包括：冷冻 时间为30-60min，冷冻温度为-200?-50°C，融化时间为15-30min，融化温度为30-40°C， 循环次数为2-5次。
[0033] 根据本发明的方法，为了更充分地破坏核酸，完全脱除细胞，完整保留板层结构， 且使得胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，使制得的脱细胞角膜组织与人角膜基质细胞具 有更好的生物相容性，优选情况下，酶消化处理的条件包括：DNA酶与缓冲液的体积比为 1:500-1500, RNA酶与缓冲液的体积比为1:1500-2500,温度为30-40°C，时间为2-4h。对于 缓冲液的种类没有特别的要求，可以为本领域常用的用于DNA酶和RNA酶的缓冲液，例如可 以为Tris-Hcl缓冲液、Hanks缓冲液或I XPBS缓冲液。
[0034] 根据本发明的方法，为了使胶原纤维束更好地形成网络结构，使胶原纤维排列 整齐，孔隙均匀规则，优选情况下，超声处理的条件包括：温度为20-40°C，超声功率为 200-500W，超声时间为2-5h。超声采用的超声仪可以为本领域常用的各种超声仪，只要能够 控制超声仪的参数，使得温度为20-40°C，超声功率为200-500W，超声时间为2-5h即可。
[0035] 根据本发明的方法，本领域技术人员应该理解的是，该方法还可以包括：在酶消化 处理之后超声处理之前、超声处理之后灭菌处理之前将角膜基质片进行清洗。对于清洗的 条件没有特别的要求，可以为本领域常规的清洗条件。优选情况下，在摇床上用无菌三蒸水 清洗3-5次，摇床的转速为100-200rpm，每次清洗的时间为5-15min。
[0036] 根据本发明的方法，对于灭菌的条件没有特别的要求，可以为本领域常用的各种 灭菌条件。为了更好地去除制得的脱细胞角膜组织的抗原性，优选情况下，灭菌的条件包 括：采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量为20-30kGy。
[0037] 根据本发明的方法，优选情况下，湿态封存处理的方式包括将经过灭菌处理得到 的产物置于保存液中封存。其中，本发明的发明人在研宄中意外发现，当保存液为含有I型 胶原蛋白和硫酸软骨素的保存液时，能够使得角膜基质在不变性的前提下长期湿态保存， 可长达6个月，因此，进一步优选地，保存液为含有I型胶原蛋白和硫酸软骨素的保存液。 本发明的发明人在研宄中进一步发现，保存液的成分对湿态保存的角膜基质的结构和成分 有重要影响，为了更好的预防脱细胞角膜组织在保存的过程中发生降解或成分转变等问 题，更好的确保角膜组织长时间不变性，更优选地，保存液的成分包括：1_5重量％的右旋 糖酐，0. 1-2重量％的I型胶原蛋白，0.05-1重量％的硫酸软骨素，0.005-0. 02重量％的抗 氧化剂，0. 005-0. 02重量％的抗生素，其余成分为三蒸水；更进一步优选地，保存液中I型 胶原蛋白的含量为0. 5-1. 5重量％，硫酸软骨素的含量为0. 4-0. 8重量％。
[0038] 根据本发明的方法，为了进一步提高角膜组织在保存液中的保存效果，优选情况 下，右旋糖酐的分子量为20-40kDa ; I型胶原蛋白的来源为猪、牛、鱼或人；抗氧化剂包括 维生素 C和/或维生素 E ;抗生素包括妥布霉素、青霉素、链霉素和庆大霉素中的至少一种。
[0039] 根据本发明的方法，为了进一步提高角膜组织在保存液中的保存效果，优选情况 下，置于保存液中封存的温度为4-8 °C。
[0040] 本发明还提供了上述方法制备得到的脱细胞角膜组织。
[0041] 本发明的脱细胞角膜组织为动物源性脱细胞板层角膜基质片，不含细胞成分，胶 原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，透光率为70% -80%。
[0042] 根据本发明的方法可知，本发明的脱细胞角膜组织以湿态封存形式存在，在使用 前用生理盐水或PBS缓冲液清洗后即可使用而无需进行复水处理，使用方便，且能够在角 膜基质不变性的前提下实现长期湿态保存，可长达6个月。
[0043] 本发明还提供了脱细胞角膜组织在作为角膜基质替代物中的应用。
[0044] 本发明的脱细胞角膜组织可用于治疗角膜外伤、角膜溃疡、混浊、疤痕、化学或热 烧伤等角膜病变。
[0045] 实施例
[0046] 以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。如无特别说 明，使用的各试剂和材料均可市售获得。
[0047] 以下实施例和对比例中，测定透光率的方法包括：对于灭菌后直接检测的材料，需 先用生理盐水充分浸泡，然后平整紧密地贴在比色皿内壁，加生理盐水，以不贴角膜基质材 料的比色皿加生理盐水作为对照；对于用保存液保存一定时间后的材料，先用生理盐水冲 洗保存液，再采用同上的方法进行操作。采用紫外-可见光分光光度计（型号：UV-5300型， 上海元析仪器有限公司）测定角膜基质材料在不同波长下（400nm、500nm、600nm、700nm、 800nm)的透光率，然后计算平均值。
[0048] 冰冻切片的方法为：将用生理盐水复水的脱细胞角膜组织浸润在OCT包埋剂中， 在-80°C的环境中速冻30min，然后固定在样品托上，修片，用冰冻切片机（型号：Thermo Cryotome FE型，美国赛默飞世尔科技公司）切片（厚度为IOym)，烤片2h，采用H. E染色 法进行染色后，用光学显微镜（型号：CKX-41SF，日本奥林巴斯公司）进行观察。
[0049] 右旋糖酐，分子量为22kDa，购自Sigma公司。
[0050] I型胶原蛋白购自Sigma公司。
[0051] 实施例1
[0052] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0053] (1)取猪眼球，并将新鲜的猪眼球用体积百分浓度为75%的酒精浸泡20s，在超净 台内，用角膜刀直接切取直径为9_，厚度为400 μ m的角膜基质片；
[0054] (2)将切取的角膜基质片放在三蒸水中浸泡IOh ;
[0055] (3)将步骤（2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷 冻时间为40min，冷冻温度为-80°C，融化时间为20min，融化温度为37°C，循环次数为3次；
[0056] (4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的Tris-Hcl缓冲液中进 行酶消化处理，DNA酶与Tris-Hcl缓冲液的体积比为1:1000, RNA酶与Tris-Hcl缓冲液的 体积比为1:2000，在37 °C的恒温箱中处理3h ;
[0057] (5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗3次，摇床的转 速为150rpm，每次清洗的时间为IOmin ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理， 超声仪参数设定分别为：温度为30°C，超声功率为300W，超声时间为3h ;
[0058] (6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗3次，摇床的转速为 150rpm，每次清洗的时间为IOmin ;然后采用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，保存备 用；
[0059] 将灭菌后的角膜基质片用生理盐水复水24h后得到脱细胞角膜组织，测定其透光 率并对其结构进行观察。其中，测得透光率为80%。生理盐水复水后的脱细胞角膜组织（已 脱细胞，放大倍数为40倍）的冰冻切片图见图1，正常人角膜板层结构（未脱细胞，放大倍 数为40倍）的冰冻切片图见图2。将图1和图2比较可知，本实施例制得的脱细胞角膜组 织具有与人角膜基质细胞相同的结构，胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角 膜基质的板层结构保留完整。
[0060] 然后对生理盐水复水后的脱细胞角膜组织进行生物学性能及生物安全性研宄和 机械性能及理化性能研宄，生物学性能及生物安全性研宄的检测方法和结果见表1，机械性 能及理化性能研宄的检测方法和结果见表2。表1和表2的结果表明，本实施例制得的脱细 胞角膜组织的生物相容性和生物安全性好；机械强度高，能够耐受手术缝线牵拉、韧性良好 并能长期应用于临床；理化性能良好；机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植 的要求，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。
[0061] (7)将灭菌后的角膜基质片置于保存液中并在6°C下密封保存，即得到可移植的 脱细胞角膜组织。其中，保存液的成分包括：3重量％的右旋糖酐，1重量％的I型胶原蛋 白，0. 6重量％的硫酸软骨素，0. 01重量％的维生素 C，0. 01重量％的妥布霉素，其余成分为 三蒸水。
[0062] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为79%。
[0063] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织的冰冻切片图同图1，S卩，密 封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织仍具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，并未发生 降解及成分转变（即未发生变性）。
[0064] 实施例2
[0065] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0066] (1)取牛眼球，并将新鲜的牛眼球用含妥布霉素的I XPBS溶液（妥布霉素的浓度 为40000U/L)浸泡30s，在超净台内，用角膜刀直接切取直径为8mm，厚度为200 μ m的角膜 基质片；
[0067] (2)将切取的角膜基质片放置于三蒸水中浸泡8h ;
[0068] (3)将步骤（2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷 冻时间为30min，冷冻温度为-200°C，融化时间为30min，融化温度为40°C，循环次数为2 次；
[0069] (4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的I XPBS缓冲液中进行 酶消化处理，DNA酶与I X PBS缓冲液的体积比为1:1500, RNA酶与I X PBS缓冲液的体积比 为1:2500，在30°〇的恒温箱中处理411;
[0070] (5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗4次，摇床的转 速为IOOrpm，每次清洗的时间为15min ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理， 超声仪参数设定分别为：温度为20°C，超声功率为500W，超声时间为2h ;
[0071] (6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗4次，摇床的转速为 lOOrpm，每次清洗的时间为15min ;然后采用钴-60辐照灭菌，辐照剂量为20kGy，保存备 用；
[0072] 将灭菌后的角膜基质片用生理盐水复水24h后得到脱细胞角膜组织，测定其透光 率并对其结构进行观察。其中，测得透光率为78 %。生理盐水复水后的脱细胞角膜组织的冰 冻切片图同图1，即，本实施例制得的脱细胞角膜组织具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整。
[0073] 然后对生理盐水复水后的脱细胞角膜组织进行生物学性能及生物安全性研宄和 机械性能及理化性能研宄，生物学性能及生物安全性研宄的检测方法和结果见表1，机械性 能及理化性能研宄的检测方法和结果见表2。表1和表2的结果表明，本实施例制得的脱细 胞角膜组织的生物相容性和生物安全性好；机械强度高，能够耐受手术缝线牵拉、韧性良好 并能长期应用于临床；理化性能良好；机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植 的要求，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。
[0074] (7)将灭菌后的角膜基质片置于保存液中并在4°C下密封保存，即得到可移植的 脱细胞角膜组织。其中，保存液的成分包括重量％的右旋糖酐，〇. 5重量％的I型胶原蛋 白，0. 8重量％的硫酸软骨素，0. 02重量％的维生素 E，0. 005重量％的青霉素，其余成分为 三蒸水。
[0075] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为78%。
[0076] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织的冰冻切片图同图1，S卩，密 封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织仍具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，并未发生 降解及成分转变（即未发生变性）。
[0077] 实施例3
[0078] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0079] (1)取猴眼球，并将新鲜的猴眼球用体积百分浓度为80%的酒精浸泡10s，在超净 台内，用角膜刀直接切取直径为1〇_，厚度为600 ym的角膜基质片；
[0080] (2)将切取的角膜基质片放置于三蒸水中浸泡12h ;
[0081] (3)将步骤（2)得到的低渗溶胀的角膜基质片放在无菌的冻存管内，反复冻融，冷 冻时间为60min，冷冻温度为-50°C，融化时间为15min，融化温度为30°C，循环次数为5次；
[0082] (4)将经反复冻融的角膜基质片放在含有DNA酶和RNA酶的Hanks缓冲液中进行 酶消化处理，DNA酶与Hanks缓冲液的体积比为1:500, RNA酶与Hanks缓冲液的体积比为 1:1500,在40 °C的恒温箱中处理2h ;
[0083] (5)将经过酶消化处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗5次，摇床的转 速为200rpm，每次清洗的时间为5min ;然后将角膜基质片置于超声仪中，进行超声处理，超 声仪参数设定分别为：温度为40°C，超声功率为200W，超声时间为5h ;
[0084] (6)将经超声处理的角膜基质片在摇床上用无菌三蒸水清洗5次，摇床的转速为 200rpm，每次清洗的时间为5min ;然后采用电子束辐照灭菌，辐照剂量为30kGy，保存备用；
[0085] 将灭菌后的角膜基质片用生理盐水复水24h后得到脱细胞角膜组织，测定其透光 率并对其结构进行观察。其中，测得透光率为76 %。生理盐水复水后的脱细胞角膜组织的冰 冻切片图同图1，即，本实施例制得的脱细胞角膜组织具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整。
[0086] 然后对生理盐水复水后的脱细胞角膜组织进行生物学性能及生物安全性研宄和 机械性能及理化性能研宄，生物学性能及生物安全性研宄的检测方法和结果见表1，机械性 能及理化性能研宄的检测方法和结果见表2。表1和表2的结果表明，本实施例制得的脱细 胞角膜组织的生物相容性和生物安全性好；机械强度高，能够耐受手术缝线牵拉、韧性良好 并能长期应用于临床；理化性能良好；机械性能、理化性能及生物学性能都满足临床移植 的要求，能够达到构建健康角膜组织、改善患者视力的效果。
[0087] (7)将灭菌后的角膜基质片置于保存液中并在8°C下密封保存，即得到可移植的 脱细胞角膜组织。其中，保存液的成分包括：5重量％的右旋糖酐，1. 5重量％的I型胶原蛋 白，〇. 4重量％的硫酸软骨素，0. 005重量％的维生素 E，0. 02重量％的链霉素，其余成分为 三蒸水。
[0088] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为75%。
[0089] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织的冰冻切片图同图1，S卩，密 封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织仍具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，并未发生 降解及成分转变（即未发生变性）。
[0090] 实施例4
[0091] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0092] 按照实施例1的方法，不同的是，步骤（7)中，保存液中I型胶原蛋白的含量为0. 1 重量％，硫酸软骨素的含量为1重量％。
[0093] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为71%。
[0094] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织的冰冻切片图同图1，S卩，密 封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织仍具有与人角膜基质细胞相同的结构， 胶原纤维排列整齐，孔隙均匀规则，无细胞残留，角膜基质的板层结构保留完整，并未发生 降解及成分转变（即未发生变性）。
[0095] 实施例5
[0096] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0097] 按照实施例1的方法，不同的是，步骤（7)中，用生理盐水代替保存液进行密封保 存。
[0098] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为22%。
[0099] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织（已脱细胞，放大倍数为40 倍）的冰冻切片图见图3,将图1和图3比较可知，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细 胞角膜组织，胶原纤维束发生一定程度的降解或断裂，且残留的胶原纤维排列紊乱，孔隙不 均匀。
[0100] 实施例6
[0101] 本实施例用于说明本发明的脱细胞角膜组织及其制备方法。
[0102] 按照实施例1的方法，不同的是，步骤（7)中，保存液中不包括I型胶原蛋白。
[0103] 经测定，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细胞角膜组织的透光率为30%。 [0104] 密封保存6个月后的本实施例制得的脱细胞角膜组织（已脱细胞，放大倍数为40 倍）的冰冻切片图见图4,将图1和图4比较可知，密封保存6个月后，本实施例制得的脱细 胞角膜组织，胶原纤维束存在一定程度的降解，且残留的胶原纤维排列凌乱、粗细不均，孔 径分布大小不均匀。
[0105] 将实施例1与实施例4比较可知，当保存液中I型胶原蛋白的含量为0. 5-1. 5重 量％，硫酸软骨素的含量为〇. 4-0. 8重量％时，密封保存6个月后，能够进一步提高制得的 脱细胞角膜组织的透光率。
[0106] 将实施例1与实施例5-6比较可知，将灭菌后的角膜基质片置于本发明的特定的 保存液（保存液的成分包括：1_5重量％的右旋糖酐，0. 1-2重量％的I型胶原蛋白，0. 05-1 重量％的硫酸软骨素，0. 005-0. 02重量％的抗氧化剂，0. 005-0. 02重量％的抗生素，其余 成分为三蒸水）中密封保存6个月，角膜基质的板层结构不会发生降解，且胶原纤维排列整 齐，孔隙均匀规则，透光率高。
[0107] 表 1
[0108]